目的:克隆小鼠肾组织中CD40胞外段基因的cDNA片段,构建原核表达质粒,然后对重组质粒进行大肠杆菌异源表达、纯化和抗原性鉴定,制备小鼠抗CD40的多克隆抗体和单克隆抗体,研究应用抗CD40抗体作为一种新型免疫佐剂在抗体研制中的作用与价值。　　方法:(1)首先用 RT-PCR方法克隆小鼠肾组织细胞中 CD40胞外段基因(exCD40)的cDNA片段,将CD40胞外段基因cDNA应用重组DNA技术插入到原核表达载体pET-28a(+)中,构建exCD40的原核表达质粒pET-28a(+)/exCD40;(2)其次将原核表达质粒转化感受态E. coli-BL21(DE3)中,经IPTG诱导目的基因的高效表达,将所得菌体通过超声裂解,并通过 SDS-PAGE电泳方法检测重组蛋白的表达形式。分别在变性条件及天然条件下采用Ni-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白,SDS-PAGE检测纯化情况,间接ELISA方法鉴定重组蛋白;(3)最后将纯化后经透析复性并浓缩的exCD40重组蛋白作为抗原免疫Balb/C小鼠,采集小鼠尾尖血,并取其中效价最高的小鼠血清制备exCD40的多克隆抗体;将骨髓瘤细胞SP2/0与分离后的小鼠脾细胞融合,通过间接ELISA法筛选经HAT选择性培养基培养的融合细胞,用有限稀释法进行亚克隆,从而最终获得阳性杂交瘤细胞株,此细胞株可稳定分泌特异性抗体。为获得大量单克隆抗体,我们将阳性单克隆细胞移植至经液体石蜡预处理的小鼠腹腔中,采集小鼠腹水上清制备单克隆抗体,用间接ELISA检测抗体的效价及特异性。　　结果:(1)经酶切、PCR和DNA测序鉴定,采用RT-PCR方法成功地获得小鼠肾组织细胞中CD40胞外段基因(exCD40)的cDNA片段,原核表达质粒构建正确。　　(2)重组质粒转化感受态E. coli-BL21(DE3)后,exCD40重组蛋白可在1.0mM IPTG条件下被诱导表达,而表达的重组蛋白可以两种形式存在,即包涵体形式(37℃,4h)或可溶性形式(25℃,9h)。在含8M尿素的变性条件下,采用Ni-NTA亲和层析方法,用咪唑梯度洗脱纯化的exCD40重组蛋白以包涵体形式存在,而在非变性条件下用单纯咪唑梯度洗脱纯化的exCD40重组蛋白则以可溶性形式存在。经 SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的纯度,包涵体形式的蛋白与可溶性形式的蛋白纯度均较高,约为90％以上,间接ELISA鉴定显示重组蛋白具有抗CD40的抗原表位。　　(3)用尿素变性纯化后复性的目的蛋白免疫Balb/C小鼠后,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,然后经筛选和克隆化,获得了一株阳性单克隆细胞株,并将其命名为2F3E2B5。　　(4)对获得的这株阳性杂交瘤细胞2F3E2B5进行效价及其抑制的检测,检测到其上清最高效价为1:8000,而抑制检测中分别采用五个浓度的exCD40蛋白(50ppb、25ppb、10ppb、5ppb、1ppb),结果仅1ppb浓度的exCD40蛋白抑制效果较差,其余4个浓度均能有效抑制住上清中的抗体,且最小抑制浓度为5ppb。　　(5)抗血清的最高效价为1:256000,并且利用量子点荧光标记技术,采用斑点印迹方法检测到此阳性血清中的exCD40多克隆抗体能够特异性的识别小鼠exCD40蛋白,从检测到的结果显示出此抗血清具有较高的特异性、敏感度和亲和力。　　结论:获得小鼠肾组织细胞中CD40胞外段基因的cDNA片段,通过原核表达实现了小鼠exCD40蛋白的高效表达。异源表达的exCD40重组蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化及免疫学实验验证具有抗CD40的抗原表位,用作免疫原的效果理想。制备的单克隆抗体其最小抑制浓度为5ppb,而获得的多克隆抗体能特异性的识别原核表达的exCD40蛋白,且具有较高的特异性、敏感度和亲和力。本研究为进一步研究抗 CD40单克隆抗体作为一种新型的分子佐剂提供了重要的实验材料。