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研究目的和意义关节炎是最常发生的衰老相关骨骼肌系统疾病,全球患病人数占总人口的26.60%0,在女性十大高发疾病中居前4位,男性居前8位。亚洲人受累关节中膝关节所占比重最大,我国60岁以上人群中膝骨关节炎(Knee Osteoarthriti s,KOA)发病率达80%。随着全球范围人口老龄化程度日渐加剧,KOA的防治研究已成为关乎国计民生的公共卫生问题。生物力学因素以及衰老后干细胞匮乏被认为是KOA致病的主要病因。近年来干细胞因其抑炎与再生的特性开展了诸多干预关节炎的研究,其全身输注调控及患处靶向注射也成为了新兴的有效干预关节炎的方法之一。针刀疗法是在传统中医经筋理论指导下,结合现代解剖及生物力学的干预方法,临床干预K0A疗效确切,其基础研究也取得一定进展,前期研究发现针刀松解肌肉-肌腱恢复膝关节力学失衡,良性应力刺激促进软骨合成代谢,缓解软骨基质降解。干细胞的成软骨分化以及旁分泌作用调节微环境能力已得到证实;干细胞是否可以在针刀调节KOA力学特性改善软骨应力环境后发挥协同作用?本研究从研究软骨细胞增殖相关因子p-AKT-GSK3 β信号通路出发,结合干细胞生物学特性,研究针刀、干细胞、针刀与干细胞结合等干预方法对KOA兔行为学、膝关节影像学、软骨形态学以及软骨细胞分子生物学的影响。旨在验证针刀结合干细胞干预KOA,加强了针刀对软骨损伤修复的分子生物学机制,同时也使干细胞疗法发挥出更出色的再生作用,为针刀结合干细胞治疗KOA提供实验依据。研究方法采用6月龄清洁健康级新西兰雄兔30只,分5组,每组6只,空白组不做任何处理,其他组Videman法左后肢仲直位固定制动造模,造模结束后休息1周开始干预。模型组不做干预;针刀组于造模后1周,于兔左膝股内侧肌、股外侧肌、股直肌及股二头肌肌腱附着点处及膝周肌腹条索结节处进行针刀操作,每周2次,连续4周;干细胞组于干预第一周将干细胞100万个溶于2m10.9%氯化钠溶液予耳缘静脉注射;第二周至第四周在每周针刀组第一次干预的同一天,干细胞10万个溶于2m10.9%氯化钠溶液予注射兔关节腔。针刀结合干细胞组,在针刀组相同操作的基础上与干细胞组同时间同部位同剂量干细胞。干预结束1周后对各组兔进行改良Lequesne MG膝关节行为评分、膝关节活动度PROM比较、膝关节MRT影像学观察、膝关节软骨扫描电镜观察,以及RT-PCR检测各组兔软骨 p-AKT、GSK3 β、CyclirnD1、CDK4 mRNA 表达,免疫组化及Western Blot 检测各组兔软骨p-AKT、GSK3 β、CyclinD1、CDK4蛋白表达。数据采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析,每组样本数据用均数土标准差(X±s)表示;若数据符合正态分布且方差齐,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),继以LSD检验进行两两比较;若方差不齐时用Welch法。若数据非正态分布采用非参数检验。以P<0.05为有统计学差异,以P<0.01为有显著统计学差异。研究成果1各组兔膝关节行为评分结果Lequesne MG评分:干预前,模型组、针刀组、干细胞组、针刀加干细胞组Lequesne MG评分与空白组相比均显著升高(P<0.01);干预后,干细胞组Lequesne MG评分与模型组相比降低(P<0.05),针刀组及针刀加干细胞组Lequesne MG评分与模型组相比均无统计学差异(P>0.05)。与干预前相比,模型组在干预后Lequesne MG评分无统计学差异(P>0.05);针刀组、干细胞组在干预后Lequesne MG评分均显著降低(P<0.01);针刀加干细胞组在干预后Lequesne MG评分降低(P<0.05)。PROM值:干预前,模型组、针刀组、干细胞组、针刀加干细胞组PROM值与空白组相比均显著降低(P<0.01);干预后,针刀组、针刀加干细胞组PROM值与模型组比较显著升高(P<0.01),干细胞组PROM值与模型组比较无统计学差异(P>0.05)。与干预前相比,模型组在干预后PROM值无统计学差异(P>0.05);针刀组、针刀加干细胞组在干预后PROM值均升高(P<0.05);干细胞组在干预后PROM值无统计学差异(P>0.05)。2各组兔膝关节MRT影像学结果正常组软骨表面光滑完整,双侧关节间隙等宽,关节腔少量积液。模型组软骨变薄,表面毛躁不光滑,关节间隙变窄,关节腔积液增多,骨髓水肿,软组织明显肿胀及筋膜积液;针刀组软骨表面基本完整,未见关节间隙狭窄,关节腔少量积液,个别仍可见软组织肿胀、筋膜水肿;干细胞组可见软骨表面毛躁,大量关节积液,可明显见软组织肿胀、筋膜水肿;针刀加干细胞组可见软骨面较毛躁,中量关节腔积液,偶见软组织肿胀、筋膜水肿。3各组兔软骨扫描电镜观察结果空白组可见软骨表面光滑,表面无定形物质均匀覆盖且隆起较浅,浅表层结构基本完整;模型组可见软骨表面无定形物质变薄甚至消失,光亮层完全消失,裸露下层胶原纤维及无定形物质下的浅表层扁平状软骨细胞;针刀组可见软骨表面粗糙见见光滑面,垄沟排列较整齐,表面无定型物质覆盖较均匀,未见剥脱及胶原纤维翻起,表面浅坑明显;干细胞组可见软骨表面粗糙,无定型物质似成块状干裂,局部甚至见剥脱,胶原翻起,浅坑结构消失,垄沟加深、增多;针刀加干细胞组可见软骨表面较光滑,无定形物质覆盖相对均匀,垄沟变深,排列规律,但见未见明显平行排列,普遍存在细小裂隙,软骨表面遍布大小、形态结构规则的陷窝,空隙均匀,胶原纤维裸露偶见。4 各组兔软骨 p-AKT、GSK3β、CyclinD1、CDK4 PCR 检测结果与空白组比较,模型组p-AKT、GSK3 β miRNA表达显著升高(P<0.01),CyclinD1、CDK4 mRNA表达降低(P<0.05)。与模型组比较,针刀组p-AKT、GSK3β mRNA表达显著降低(P<0.01),CyclinD1、CDK4mRNA 表达升高(P<0.05,P<0.01);干细胞组 p-AKT、GSK3β mRNA表达显著降低(P<0.01),CDK4 mRNA表达显著升高(P<0.01);针刀加干细胞组p-AKT、GSK3β mRNA表达显著降低(P<0.01),CyclinD1、CDK4mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01)。与干细胞组相比,针刀组及针刀加干细胞组GSK3β mRNA表达显著降低(P<0.01)、CDK4 mRNA表达升高(P<0.05)。5各组兔软骨p-AKT、GSK3 β、CyclinD1、CDK4免疫组化结果与空白组比较,模型组p-AKT、GSK3β蛋白表达显著升高(P<0.01),CyclinD1、CDK4蛋白表达显著降低(P<0.01)与模型组比较,针刀组p-AKT蛋白表达降低(P<0.05),CycliniD1蛋白表达升高(P<0.05);针刀加干细胞组p-AKT、GSK3β蛋白表达降低(P<0.05),CyclinD1、CDK4蛋白表达升高(P<0.01)。针刀)组、干细胞组、针刀加干细胞组三组间两两比较,p-AKT、GSK3 β、CyclinD1、CDK4蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。6 各组兔软骨 p-AKT、GSK3 β、CyclinD1、CDK4 Western Blot 检测结果与空白组比较,模型组p-AKT、GSK3 β蛋白表达显著升高(P<0.01),CyclinD1、CDK4蛋白表显著降低(P<0.01)。与模型组比较,针刀组CyclinD1蛋白表达显著升高(P<0.01);针刀加干细胞组p-AKT、GSK3 β蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),CyclinD1、CDK4蛋白表达显著升高(P<0.01)。针刀组、干细胞组、针刀加干细胞组三组间两两比较,p-AKT、GSK3 β蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05);与干细胞组比较,针刀组CyclinD1蛋白表达升高(P<0.05),针刀加干细胞组CyclinD1、CDK4蛋白表达升高(P<0.05);与针刀组比较,针刀加干细胞组CDK4蛋白表达升高(P<0.05)。研究结论1针刀及干细胞干预均可抑制KOA兔膝关节炎性反应,缓解软骨退变,改善关节活动能力。但针刀干预在改善膝关节活动上更具优势,干细胞干预在降低KOA级别上更具优势;2针刀及干细胞干预均可对KOA软骨细胞增殖相关因子p-AKT、GSK3 β、CyclinD1及CDK4 mRNA与蛋白的表达发挥调控作用,而针刀联合干细胞可以协同降低KOA软骨细胞中p-AKT、GSK3 β mRNA与蛋白的表达,协同促进CyclinD1、CDK4 mRNA与蛋白的表达,证实针刀与干细胞联合更有利于KOA软骨损伤后修复。