樟疫霉（Phytophthora cinnamoni）的寄主广泛,能够侵染5000多种植物。樟疫霉被认为是降低生物多样性的威胁之一,导致欧洲、美洲和亚洲的森林面积减少。在中国,樟疫霉可以引起多种农林作物的枝干或根部腐烂。目前研究发现疫霉在侵染寄主过程中分泌大量的效应蛋白对植物的免疫系统进行攻击,其中有一类庞大的蛋白家族被称为Rx LR效应子,这类蛋白序列中在信号肽后含有一段保守的Arg-X-Lys-Arg（Rx LR）序列特征。樟疫霉基因组中编码了266个Rx LR类效应子,但目前有关樟疫霉效应蛋白的研究报道较少,且效应蛋白如何调控寄主免疫的分子机制所知甚少。本论文基于前期研究获得了能够抑制INF1和Bax诱导的细胞死亡的效应子PcAvh87,初步说明PcAvh87在疫霉菌与植物互作过程中可能发挥了一定功能。为明确PcAvh87在樟疫霉致病中的作用,本研究利用绿色荧光蛋白（GFP）建立了一种稳定、高效的PEG/Ca Cl2介导的樟疫霉遗传转化体系,进一步基于CRISPR/Cas9系统介导的NHEJ（Nonhomologous end joining）非同源替换成功获得了PcAvh87基因的敲除转化子,从而探索效应子PcAvh87基因功能;采用高通量RNA-seq技术对PcAvh87敲除突变体菌株在菌丝阶段和游动孢子阶段进行了转录组比较分析,了解其可能调控的下游信号通路;为探索抑制细胞死亡的效应子PcAvh87橾控植物免疫的分子机制,本研究构建了草本植物羽扇豆文库,通过酵母双杂筛选和鉴定效应蛋白PcAvh87的互作蛋白。本研究有望揭示疫霉菌效应子在防御林木寄主过程中的新机制,有助于提升对林木疫病致病机制的认识,为开发林木疫病的新型防控策略奠定理论基础。主要研究结果如下:1.利用绿色荧光蛋白（GFP）定位示踪是研究植物病原体与宿主互作最有效的细胞学方法。通过筛选适宜的菌株、酶液浓度、酶解时间及酶解温度来解决樟疫霉原生质体制备困难的难题,探索出适合樟疫霉的原生质体制备和再生的方法,最终确定樟疫霉遗传转化体系的菌株为ATCC 15400,酶液浓度为5 mg/m L,酶解时间为50 min以及酶解温度为25℃。通过PCR验证和荧光显微镜观察进行转化菌株的筛选,共有3个转化子成功扩增出目的条带,并在不同无性发育阶段均有GFP荧光表达,原生质体转化效率为15%。对转化子菌落形态与直径、游动孢子囊形成、游动孢子释放数量,以及致病性等生物学性状进行测定,发现转化子对樟疫霉的营养生长、发育过程以及与致病力没有影响。进一步对转化子与寄主互作过程进行研究,在寄主细胞内观察到侵染菌丝能够成功表达GFP。因此,本研究成功构建了一种稳定、高效的PEG/Ca Cl2介导的樟疫霉原生质体遗传转化体系。2.为了明确效应子PcAvh87在进化过程中面临的寄主选择压力,对来自不同国家和寄主的8株樟疫霉菌株的效应子PcAvh87的序列多态性进行了分析,检测到氨基酸水平的2个位点的变异。通过Blast P比对,发现PcAvh87的同源蛋白只存在于疫霉中。在本氏烟上瞬时表达PcAvh87后,促进了烟草疫霉的侵染,初步说明PcAvh87在疫霉菌与植物互作过程中可能发挥了一定功能。为进一步明确PcAvh87在樟疫霉致病中的作用,利用稳定、高效的樟疫霉原生质体遗传转化体系,基于CRISPR/Cas9系统介导的NHEJ（Nonhomologou s end joining）非同源替换,成功获得了PcAvh87基因的敲除突变体。对敲除突变体的各发育阶段进行生物学测定和致病性测定,结果显示,PcAvh87敲除突变体菌丝生长速率显著下降、孢子囊数量显著下降、游动孢子提前休止、休止孢萌发率显著下降,休止孢畸形率显著上升、在外源过氧化氢的刺激下生长受到显著抑制以及致病力显著降低,表明PcAvh87能够影响菌丝生长的调控、孢子囊的形成、游动孢子的释放、休止孢的发育以及对氧化应激的耐受性。因此,PcAvh87效应子在樟疫霉的致病过程中发挥重要作用,是一个与致病性相关的效应子。3.本研究应用高通量RNA-seq技术对樟疫霉野生型菌株ATCC 15400和PcAvh87敲除突变体菌株T5在菌丝阶段和游动孢子阶段进行了转录组比较分析,测序共获得超过84.62G的数据量。通过PHI数据库比对,菌丝阶段有339个基因差异表达,游动孢子阶段有508个,显著上调的有320个,显著下调的有188个,这些PHI基因主要包括植物细胞壁降解酶、NLP、激发子和Rx LR效应子等。结果表明,由于樟疫霉效应子PcAvh87的敲除,在樟疫霉基因组中大约有1/10的基因的表达发生变化,而且大部分基因表达下调。在细胞壁降解酶和效应子中差异表达基因较多,细胞壁降解酶有85个,效应子有36个,包括13个激发子、7个NLP和16个Rx LR效应子。4.本研究通过酵母杂交技术筛选效应子PcAvh87在羽扇豆体内互作的蛋白,以解析病原菌侵染策略的影响因素,结果显示,构建的羽扇豆酵母杂交文库滴度为7.38×106CFU/m L,在羽扇豆酵母杂交文库中共筛选到68个互作蛋白,筛选到的互作蛋白功能涉及逆境响应、免疫调节和植物发育等,其中两个强互作蛋白分别是Avh87-113和Avh87-123。Av h87-113是NHL1的同源蛋白。NHL1（NDR1/H1N1-Like）是拟南芥基因组数据库中发掘出来的与拟南芥NDRl（Non-race-specific disease resistance 1）和烟草H1N1（Harpin ind uced gene1）基因序列同源的基因,是一些抗病基因（Resistance gene）产物诱导的拟南芥对细菌和菌物病原体的抵抗所必须的基因,NHL1家族在多种植物防卫、免疫反应中起到重要作用。Avh87-123的功能注释为小类泛素修饰因子（SUMO-1）,SUMO-1修饰因子在植物发育、调控激素水平、抗病以及应对逆境响应等方面起重要作用。后期对这两个蛋白进行深入研究挖掘PcAvh87在寄主中的互作蛋白,有助于深入理解和揭示效应子PcAvh87操控寄主蛋白抑制植物的防卫反应的分子机制。