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肺炎克雷伯菌为临床感染常见病原菌,但随着抗菌药物的广泛使用,肺炎克雷伯菌对β内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等常见抗菌药物耐药性呈现上升趋势,多重耐药菌成为临床一大难题,而碳青霉烯类抗生素几乎是其最后防线。细菌耐药进化与人类抗生素使用之间的博弈从未停歇,随着KPC型、NDM-1型碳青霉烯酶基因的广泛传播,碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)在世界各地分离率逐年上升,新的抗菌药物防线亟需建立。替加环素作为米诺环素的衍生物之一,不仅克服了四环素类药物的常见耐药机制,还被发现对多重耐药菌有良好的抗菌效果,但替加环素上市后不久就很快发现了替加环素耐药菌株,替加环素耐药碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Tigecycline-resistant carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,TR-CRKP)的临床感染现状,以及替加环素耐药机制的研究有待进一步完善。本研究通过三部分内容,分析了 CRKP的耐药现状、对替加环素耐药菌株进行临床感染的危险因素、临床分布情况分析,并对一位患者分离到的连续菌株进行替加环素耐药机制研究。第一部分,主要研究CRKP的耐药现状,以及TR-CRKP临床感染的常见危险因素。我们收集了 286株CRKP临床菌株(同一患者多次送检则仅保留第一株),通过微量肉汤稀释法、琼脂糖凝胶稀释法测定这些菌株对几种常见抗生素的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC);同时收集286株菌株相对应患者的临床资料,包括年龄、性别、身高、体重基本信息;基础疾病、住院天数、重症监护天数、预后;以及采集到该菌株前3月内接受的侵入性操作和抗生素种类、剂量等客观信息。对非替加环素耐药组vs替加环素耐药组(替加环素MIC≥8mg/L,FDA标准)进行统计学分析对比。结果:1)286株CRKP菌株对三种碳青霉烯类抗生素高度耐药,对替加环素、多粘菌素、头孢他啶/阿维巴坦、磷霉素、阿米卡星、氨曲南的耐药率分别为 1 6.4%、4.9%、3.8%、25.5%、41.6%、99.7%;2)该院CRKP感染群体以老年、男性、外科住院人群、院内感染为主要特征;3)标本来源中,以呼吸道、胆道、泌尿道、血流感染为主;4)TR-CRKP感染者有更高的重症监护室(Intensivecare unit,ICU)入住率、更多的气管插管、导尿管留置、胃管留置、替加环素的使用,而与一些基础疾病无关。结论:该院CRKP菌株替加环素耐药情况严峻,头孢他啶阿维巴坦、多粘菌素、磷霉素尚可作为有效治疗选择,对氨曲南及碳青霉烯类则高度耐药。CRKP以院内感染为主,以老年、男性、外科患者为主要特征。TR-CRKP感染者有更高的ICU入住率,TR-CRKP感染的危险因素包括替加环素的使用、气管插管、导尿管留置、胃管留置,可作为院感防控的着手点。第二部分,主要研究TR-CRKP菌株的临床分布情况。上述收集到的TR-CRKP共有47株,对替加环素耐药菌株(替加环素MIC≥8mg/L,FDA标准)进行全基因组测序(Whole genome sequencing,WGS)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分析,并进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)。结果:共计有47株TR-CRKP菌株,其中43株属于ST11,另四株分别为ST268、ST15、ST1886、ST485。PFGE结果:其中42株分别属于5个主要克隆型簇(A-E型),另外有5株细菌为低相似度的克隆型。结论:替加环素耐药碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的感染以院内克隆传播为主,少数为独立事件,这意味着加强院内感染防控或可有效降低感染率。第三部分,主要研究在临床替加环素治疗过程中,CRKP菌株出现替加环素耐药性变化的相关机制。我们选取一位住院患者在替加环素治疗过程中分离的系列菌株,以微量肉汤稀释法检测替加环素MIC值,并对系列菌株进行PFGE分析、全基因组测序、耐药基因对比、MLST分型,通过全基因组测序,分析差异单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与大片段插入的发生,以质粒回补方式确认基因功能。结果:来自同一患者的系列菌株A814、A112、A113,替加环素MIC值分别为4mg/L、4mg/L、16mg/L,同属ST11型,PFGE验证属于同一克隆型,常见耐药基因无差异,通过比较基因组学分析发现,A113的ramR基因存在一个ISkpn18插入序列,回补载有野生型ramR基因的重组质粒pCR2.1-Hyg-ramR至A113感受态细胞中,回补菌株的替加环素MIC值降至8mg/L。结论:本研究首次报导了“ramR基因被ISkpn18插入失活”引起的CRKP菌株替加环素耐药。临床患者在替加环素疗程中,CRKP菌株的ramR基因被插入失活,与其替加环素耐药性增加相关;但可能还有其它潜在机制尚未被发现。