第一部分：若干补肾益气中药组分对哮喘小鼠气道炎症的影响　　目的：根据激发的次数和时间的长短，建立急性和慢性哮喘小鼠模型，从动物行为学、小鼠气道反应性、肺组织病理学、血清中OVA-IgE水平及相关炎性细胞因子等多方面，分析比较两种哮喘模型气道炎症的特点，并观察补肾益气中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷及两者组成的复方对急性与慢性哮喘小鼠气道炎症的影响。方法：(1)192只雌性Ba1b/c小鼠随机分为24组，每组8只，分别为：急性哮喘组(12组)：急性正常对照组(A1组)、急性哮喘模型组(B1组)、地塞米松1mg/kg组(C1组)、淫羊藿苷低、中、高剂量组(D1-F1组)、黄芪甲苷低、中、高剂量组(G1-I1组)、淫羊藿苷+黄芪甲苷低、中、高剂量组(J1-L1组)；慢性哮喘组(12组)：慢性正常对照组(A2组)、慢性哮喘模型组(B2组)、地塞米松1mg/kg组(C2组)、淫羊藿苷低、中、高剂量组(D2-F2组)、黄芪甲苷低、中、高剂量组(G2-12组)、淫羊藿苷+黄芪甲苷低、中、高剂量组(J2-L2组)；(2)模型建立及给药：采用OVA致敏和激发建立哮喘小鼠模型，用OVA激发2周共7次建立急性哮喘小鼠模型；用OVA激发6周共21次建立慢性哮喘小鼠模型，每次激发前1小时腹腔注射给药；(3)取材：最后一次激发6-12小时，用WBP全身体积描计仪检测小鼠的Penh值；最后一次激发24小时后，麻醉后心脏取血，取肺泡灌洗液及肺组织；(4)观察动物行为学改变；用Penh的增长百分比(Penh％)来反映小鼠气道反应性；进行肺病理HE染色及肺组织炎症病理评分：用ELISA检测小鼠血清中OVA-IgE的水平；用Luminex200检测小鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α等5种炎性细胞因子的水平。　　结果：(1)急性与慢性哮喘小鼠气道炎症特点的比较：　　①同正常对照组相比，卵蛋白(OVA)所诱导的急性哮喘模型组小鼠可出现头面部瘙痒，呼吸加深，呼吸频率加快，弓背，前肢缩抬，安静少动等哮喘急性发作表现，而慢性哮喘模型组小鼠激发后症状更加明显，部分可伴有口唇、爪等不同程度的紫绀，同时伴有体重增长曲线缓慢。　　②正常对照组小鼠多在雾化吸入Mch25-50mg/ml时，出现呼吸频率加快，腹式呼吸，小鼠流涎，伴口唇、爪紫绀等呼吸困难症状。与相应正常对照组相比，哮喘模型组小鼠可较早出现呼吸困难的症状；急性与慢性哮喘模型组小鼠气道反应性(Penh％)均较相应正常组升高，且急性哮喘模型组小鼠升高更加明显。　　③从肺病理学观察，急性哮喘模型组小鼠肺组织气道黏膜可见水肿，支气管管腔缩小，部分可见黏液栓子，气道周围血管壁水肿充血，气道黏膜层、黏膜下层及血管周围有大量的炎性细胞浸润，主要以嗜酸粒细胞、单核细胞及淋巴细胞浸润为主，而慢性哮喘模型组小鼠肺组织除上述变化外，部分可见黏膜基底层增厚，上皮细胞轻度变性，细胞排列轻度紊乱等病理改变。　　④与相应正常对照组相比，急性与慢性哮喘模型组小鼠血清特异性OVA-IgE的水平均升高，且慢性哮喘模型组小鼠升高更为明显。　　⑤与相应正常对照组相比，哮喘模型组小鼠血清中TNF-α的水平均升高；但与相应正常组比较，IFN-γ在急性哮喘模型组小鼠血清中浓度无明显变化，而在慢性哮喘模型组中却有升高的趋势；IL-4在正常对照组及急性哮喘模型组中均无法检测，而在部分慢性哮喘模型组小鼠血清中可以检测出。　　(2)补肾益气中药组分对急性哮喘小鼠气道炎症的影响：　　①与急性哮喘模型组(B1组)比较，淫羊藿苷组(D1-F1组)、黄芪甲苷组G1-I1组)及复方组(J1-L1组)小鼠哮喘症状表现均较模型组减轻；补肾益气中药组分组(D1-L1组)小鼠肺组织在炎症细胞浸润、黏液分泌，血管壁水肿、血管周围渗出等方面也有不同程度的减轻。　　②与急性哮喘模型组(B1组)比较，淫羊藿苷组(D1-F1组)小鼠出现呼吸困难的时间较晚，且淫羊藿苷组(D1-F1组)小鼠Penh％下降。　　③与急性哮喘模型组(B1组)比较，淫羊藿苷组(D1-F1组)、黄芪甲苷低、中剂量组(G1、H1组)及复方中、高剂量组(K1-L1组)小鼠血清中OVA-IgE水平均下降。　　④与急性哮喘模型组(B1组)比较，淫羊藿苷组(D1-F1组)小鼠血清中TNF-α的水平有下降的趋势，且淫羊藿苷中剂量组(E1组)IFN-γ的水平有下降的趋势；黄芪甲苷组(G1-I1组)小鼠血清中TNF-α的水平有下降的趋势，且黄芪甲苷高剂量组(I1组)IFN-γ的水平也有下降的趋势；复方中剂量组(K1组)小鼠血清中IFN-γ的水平有下降的趋势。同时，各急性组小鼠血清中IL-4和IL-10均无法检测出。　　(3)补肾益气中药组分对慢性哮喘小鼠气道炎症的影响：　　①与慢性哮喘模型组(B2组)比较，补肾益气中药组分可改善哮喘小鼠的症状；同时，慢性哮喘小鼠的肺组织炎症损伤程度也减轻。　　②与慢性哮喘模型组(B2组)比较，补肾益气中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷及复方组(D2-L2组)小鼠出现呼吸困难的时间较晚，且黄芪甲苷组(G2-I2组)及复方组(J2-L2组)小鼠Penh％下降较明显。　　③淫羊藿苷组(D2-F2组)小鼠血清中OVA-IgE水平均显著下降(P>0.05，P<0.01)，黄芪甲苷低剂量组(G2组)小鼠血清中OVA-IgE水平明显下降(P<0.05)，而黄芪甲苷中、高剂量组(H2组、12组)水平升高，但差异均无显著意义(P>0.05)；复方组(J2-L2组)小鼠血清中OVA-IgE水平均下降，且复方中剂量组(K2组)降低最为明显，差异有显著意义(P<0.05)。　　④与慢性哮喘模型组(B2组)比较，淫羊藿苷组(D2-F2组)小鼠血清中IFN-γ和IL-6的浓度均有下降的趋势，且淫羊藿苷组小鼠BALF中IFN-γ的浓度也有较明显的下降趋势；黄芪甲苷低、高剂量组(G2、I2组)小鼠血清TNF-α的浓度有下降的趋势，黄芪甲苷中、高剂量组(H2组、I2组)小鼠血清中IFN-γ的浓度有下降的趋势，黄芪甲苷中剂量组(H2组)小鼠血清中IL-6的浓度有下降的趋势；复方组(J2-L2组)小鼠血清中IL-6和TNF-α的浓度均有下降的趋势，且复方中、高剂量组(K2组、L2组)小鼠血清中IFN-γ的浓度有下降的趋势。同时，IL-10在所有慢性组小鼠血清中均未检测出，而IL-4可在部分慢性哮喘小鼠血清中检测出。　　结论：　　(1)从动物行为学、气道反应性、肺组织病理学、血清中OVA-IgE水平、血清中炎性细胞因子水平等多方面，比较急性与慢性哮喘模型组小鼠，可发现延长OVA激发次数和时间所造成的慢性哮喘小鼠模型可能更符合哮喘的临床表现和气道慢性炎症特点，更适合进一步探讨哮喘的发病机制。　　(2)补肾益气中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷及两者的复方均可改善哮喘小鼠的症状，减轻哮喘小鼠肺组织的炎症损伤，降低哮喘小鼠的气道反应性，使哮喘小鼠血清中OVA-IgE及相关炎性细胞因子的水平下降，从而减轻急性与慢性哮喘小鼠气道炎症与气道反应性。　　第二部分：若干补肾益气中药组分对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞浸润的影响　　目的：观察补肾益气中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷及两者的复方对急性与慢性哮喘小鼠气道中嗜酸性粒细胞浸润的影响，并进一步观察这一作用是否与其调节嗜酸性粒细胞趋化因子、趋化因子受体有关。　　方法：(1)144只雌性Balb/c小鼠随机分为24组，每组6只，分别为：急性哮喘组(12组)：急性正常对照组(A1组)、急性哮喘模型组(B1组)、地塞米松1mg/kg组(C1组)、淫羊藿苷低、中、高剂量组(D1-F1组)、黄芪甲苷低、中、高剂量组(G1-I1组)、淫羊藿苷+黄芪甲苷低、中、高剂量组(J1-L1组)；慢性哮喘组(12组)：慢性正常对照组(A2组)、慢性哮喘模型组(B2组)、地塞米松1mg/kg组(C2组)、淫羊藿苷低、中、高剂量组(D2-F2组)、黄芪甲苷低、中、高剂量组(G2-I2组)、淫羊藿苷+黄芪甲苷低、中、高剂量组(J2-L2组)；(2)模型建立及给药：采用OVA致敏和激发建立哮喘小鼠模型，用OVA激发2周共7次建立急性哮喘小鼠模型；用OVA激发6周共21次建立慢性哮喘小鼠模型，每次激发前1小时腹腔注射给药；(3)取材：最后一次激发24小时后，麻醉后心脏取血，取肺泡灌洗液及肺组织；(4)观察淫羊藿苷、黄芪甲苷及复方对哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞计数的影响；采用Luminex200检测小鼠血清中eotaxin、MCP-3、RANTES、IL-3、IL-5和GM-CSF等6种趋化因子和细胞因子的水平；用realtime-PCR观察补肾益气中药组分对哮喘小鼠肺组织中相关趋化因子受体CCR3、CCR5mRNA表达的影响；用免疫印迹观察补肾益气中药组分对哮喘小鼠肺组织中趋化因子受体CCR3、CCR5及NF-κBp65蛋白的影响。　　结果：(1)补肾益气中药组分对急性哮喘小鼠嗜酸性粒细胞浸润的影响：　　①与急性哮喘模型组(B1组)比较，淫羊藿苷组(D1-F1组)、黄芪甲苷组(G1-I1组)及复方组(J1-L1组)小鼠BALF中嗜酸性粒细胞的数量均减少。　　②与急性哮喘模型组(B1组)相比，淫羊藿苷组(D1-F1组)小鼠血清中eotaxin水平均下降，且淫羊藿苷低、中剂量组(D1组、E1细水平显著下降(P<0.05，P<0.01)；黄芪甲苷中、高剂量组(H1组、I1组)小鼠血清中eotaxin的水平均下降，但无统计学意义，黄芪甲苷低剂量组(G1组)eotaxin的水平明显升高(P<0.01)；复方组(J1-L1组)小鼠血清中eotaxin的水平均下降，但无统计学意义。　　③与急性哮喘模型组(B1组)相比，淫羊藿苷中剂量组(E1组)小鼠血清中MCP-3的水平下降，而淫羊藿苷低、高剂量组(D1组、F1组)的水平升高，且淫羊藿苷高剂量组显著升高(P<0.01)：黄芪甲苷组(H1-J1组)小鼠血清中MCP-3的水平均升高，但无统计学意义；复方组(J1-L1组)小鼠血清中MCP-3的水平均升高，且复方高剂量组(L1组)水平显著升高(P<0.01)。　　④与急性哮喘模型组(B1组)比较，淫羊藿苷组(D1-F1组)小鼠血清中IL-5、GM-CSF和RANTES的水平有下降的趋势；黄芪甲苷低、中剂量组(G1-H1组)小鼠血清中GM-CSF、IL-5和RANTES的水平有下降的趋势；复方中剂量组(K1组)小鼠血清中GM-CSF、IL-5和RANTES的水平有下降的趋势；各组小鼠血清中IL-3均无法检测出。　　⑤与急性哮喘模型组(B1组)相比，淫羊藿苷低剂量组(D1组)小鼠肺组织中CCR3mRNA的表达显著下降(P<0.01)；黄芪甲苷高剂量组(I1组)小鼠肺组织中CCR3mRNA的表达明显下降(P<0.05)；复方低、高剂量组(J2组、L2组)小鼠肺组织中CCR3mRNA的表达下降，但均无统计学意义。与急性哮喘模型组(B1组)相比，淫羊藿苷组(D1-F1组)、黄芪甲苷组(G1-I1组)和复方组(J1-L1组)小鼠肺组织中CCR5mRNA的表达均明显下降(P<0.05，P<0.01)。　　⑥与急性哮喘模型组(B1组)比较，淫羊藿苷组(D1-F1组)能抑制哮喘小鼠肺组织中CCR3蛋白的表达，其中，淫羊藿苷低、中剂量组(D1-E1组)抑制作用较为明显；黄芪甲苷组(G1-I1组)能抑制哮喘小鼠肺组织中CCR3蛋白的表达，其中，黄芪甲苷低、高剂量组(G1组、I1组)作用较明显；复方组(J1-L1组)小鼠肺组织中CCR3蛋白的表达均降低。与急性哮喘模型组(B1组)比较，补肾益气中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷及两者复方均能抑制急性哮喘小鼠肺组织中CCR5蛋白的表达。　　⑦与急性哮喘模型组(B1组)比较，淫羊藿苷组(D卜Fl组)、黄芪甲苷组(G1-I1组)及复方组(J1-L1组)均未能明显抑制哮喘小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的表达。　　(2)补肾益气中药组分对慢性哮喘小鼠嗜酸性粒细胞浸润的影响：　　①与慢性哮喘模型组(B2组)比较，淫羊藿苷组(D2-F2组)、黄芪甲苷组(G2-I2组)及复方组(J2-L2组)小鼠BALF中嗜酸性粒细胞的数量均减少。　　②与慢性哮喘模型组(B2组)相比，淫羊藿苷低、高剂量组(D2组、F2组)小鼠血清中GM-CSF的水平下降，且淫羊藿苷高剂量组(F2组)显著下降(P<0.05)；黄芪甲苷中、高剂量组(H2组、I2组)小鼠血清中GM-CSF的水平显著下降(P<0.05)；复方组(J2-L2组)小鼠血清中GM-CSF的水平下降，且复方低剂量组(J2组)中GM-CSF水平最低，但均无统计学意义。　　③与慢性哮喘模型组(B2组)相比，淫羊藿苷组(D2-F2组)小鼠血清中eotaxin的水平均下降，且淫羊藿苷中剂量组(E2组)的水平明显下降(P<0.05)；黄芪甲苷组(G2-I2组)小鼠血清中eotaxin的水平下降，但无统计学意义；复方组(J2-L2组)小鼠血清中eotaxin的水平均下降，且复方低剂量组(J2组)中eotaxin水平最低，但均无统计学意义。　　④与慢性哮喘模型组(B2组)相比，淫羊藿苷组(D2-F2组)小鼠血清中MCP-3的水平下降，且淫羊藿苷高剂量组(F2组)小鼠的MCP-3的水平下降最明显，但无统计学意义；黄芪甲苷低、高剂量组(G2组、I2组)小鼠血清中MCP-3的水平下降，黄芪甲苷中剂量组(H2组)MCP-3的水平升高，但均无统计学意义：复方组(J2-L2组)小鼠血清中MCP-3的水平均升高，且复方高剂量组(L2组)最高，但均无统计学意义。　　⑤与慢性哮喘模型组(B2组)比较，淫羊藿苷组(D2-F2组)小鼠血清中IL-5的浓度有下降的趋势；黄芪甲苷中、高剂量组(H2组、I2组)小鼠血清中IL-5的浓度有下降的趋势；复方组(J2-L2组)小鼠血清中IL-5的浓度有下降的趋势。IL-3在所有小鼠血清中均未检测出。　　⑥与慢性哮喘模型组(B2组)相比，淫羊藿苷中、高剂量组(E2-F2组)小鼠BALF中eotaxin的浓度有较明显的下降趋势。IL-3、IL-5、GM-CSF、MCP-3和RANTES均无法在小鼠BALF中检测出。　　⑦与慢性哮喘模型组(B2组)比较，淫羊藿苷低、中剂量组(D2组、E2组)小鼠肺组织中CCR3mRNA的表达显著下降(P<0.05，P<0.01)；黄芪甲苷高剂量组(I2组)小鼠肺组织中CCR3mRNA的表达明显下降(P<0.05)；复方组(J2-L2组)小鼠肺组织中CCR3mRNA的表达均下降，但无统计学意义。与慢性哮喘模型组(B2组)相比，淫羊藿苷组(D2-F2组)小鼠肺组织中CCR5mRNA的表达无明显变化；黄芪甲苷中、高剂量组(H2组、I2组)小鼠肺组织中CCR5mRNA的表达下降，但无统计学意义；复方中、高剂量组(K2组，L2组)小鼠肺组织中CCR5mRNA的表达下降，但也无统计学意义。　　⑧与慢性哮喘模型组(B2组)比较，补肾益气中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷及两者复方均能抑制慢性哮喘小鼠肺组织中CCR3蛋白的表达。与慢性哮喘模型组(B2组)比较，淫羊藿苷和复方组(D2-F2组，J2-L2组)均不能明显改变慢性哮喘小鼠肺组织中CCR5蛋白的表达；而黄芪甲苷高剂量组(I2组)能较明显抑制慢性哮喘小鼠肺组织中CCR5蛋白的表达。　　⑨与慢性哮喘模型组(B2组)比较，淫羊藿苷组(D2-F2组)肺组织中NF-κBp65蛋白的表达下降，其中，淫羊藿苷中剂量组(E2组)小鼠肺组织中NF-κBp65蛋白的表达最低；黄芪甲苷组(G2-I2组)肺组织中NF-κBp65蛋白的表达下降，其中，黄芪甲苷高剂量组(I2组)肺组织中NF-κBp65蛋白的表达最低；复方组(J2-L2组)肺组织中NF-κBp65蛋白的表达也下降，其中，复方低剂量组(J2组)肺组织中NF-κBp65蛋白的表达最低。　　结论：　　(1)补肾益气中药组分淫羊藿苷、黄芪甲苷均可抑制急性与慢性哮喘小鼠气道中嗜酸性粒细胞的浸润，从而减轻哮喘小鼠的气道炎症和气道反应性，此作用与其降低嗜酸性粒细胞趋化因子的水平及相关趋化因子受体的表达有关。　　(2)与益气中药组分黄芪甲苷比较，补肾中药组分淫羊藿苷可更明显降低急性与慢性哮喘小鼠血清中趋化因子eotaxin的水平，抑制小鼠肺组织中趋化因子受体CCR3的表达，从而减少哮喘小鼠气道中嗜酸性粒细胞的浸润。　　(3)应用补肾中药组分淫羊藿苷后，可明显降低哮喘小鼠血清中趋化因子eotaxin的水平，抑制哮喘小鼠肺组织中趋化因子受体CCR3的表达，其作用与地塞米松类似，甚至优于地塞米松的治疗，显示其具有类激素作用。　　(4)补肾中药组分淫羊藿苷和益气中药组分黄芪甲苷联合应用可降低哮喘小鼠血清中相关趋化因子的水平，抑制小鼠肺组织中相关趋化因子受体的表达，减少哮喘小鼠气道中嗜酸性粒细胞的浸润，从而减轻哮喘小鼠的气道炎症和气道反应性，提示两者联合应用具有协同作用，但其作用未达到预期效果，中药单体小复方的配伍需要进一步的探讨。