论文部分内容阅读
本研究利用β-葡萄糖苷酶的活性筛选策略,对课题组前期构建的碱性污染土壤样品的宏基因组文库AL01进行筛选,得到了一个表达β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆pGXAG805。对其进一步亚克隆和序列分析,获得两个可能编码新型β-葡萄糖苷酶的基因的开放阅读框,分别命名为:bgl1D(Genbank登录号为FJ686869)和bgl1E(Genbank登录号为FJ686868)。
生物信息学分析表明:bgl1D基因由519个碱基对组成,bgl1E基因由456个碱基对组成。在核苷酸水平上,bgl1D、bgl1E与已知数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。在氨基酸水平上,Bgl1D与其他糖基水解酶蛋白的相似性很低,与来源于弗兰克氏细菌的糖基水解酶家族3的蛋白有25％的相似性;Bgl1E和来自嗜热网球菌的一种属于糖基水解酶蛋白质家族4的水解酶有41％的相似性,和来自Flavobacterium johnsoniae UW101的一种扁桃体消旋酶蛋白有29％的相似性,和来自嗜热网球菌的一种6-磷酸式-β-葡萄糖苷酶有39％的相似性。
将PCR扩增得到的目标ORF与载体pETBlue-2连接,转化E.coliBL21(DE3),得到重组菌株pGXAG801、pGXAG803,在含有柠檬酸铁铵和七叶苷的LA平板上均能表现出β-葡萄糖苷酶活性。
编码产物经镍柱纯化后,以pNPGlu为底物,对其进行了酶学性质的初步研究,得到以下结论。Bgl1D的最适pH为10.0;最适温度为30℃;Km可能为0.54 mmol/L;Vmax可能为2.01μmol/min;最适条件下酶活可能为4.91 U/mg;Al3+、Li+、Cu2+、Co2+、Cr3+离子对酶反应有激活作用,Zn2+、Ba2+、Fe3+离子有抑制作用;高浓度葡萄糖对酶活有抑制作用,抑制常数可能为62.2 mM;半衰期可能6 h。Bgl1E的最适pH为10.0;最适温度为25℃:Km可能为2.12 mmol/L;Vmax可能为4.17μmol/min;最适条件下酶活可能为6.12 U/mg;Zn2+、Ba2+、Fe3+离子对酶反应有抑制作用;高浓度葡萄糖对酶活有抑制作用,抑制常数可能为47.1 mM;半衰期可能为14 h。
本工作一方面从生物信息学角度预测了基因bgl1D,bgl1E可能是编码新型糖基水解酶家族的种子,另一方面从基因的克隆、表达及表达产物的酶学性质分析角度验证了生物信息学的预测,为构建一种新型的糖基水解酶蛋白质家族打下坚实基础。