具有“三致”效应的多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）污染造成了巨大的环境危害,威胁人类健康和生存。荧蒽是四环的高分子量PAHs,因在结构上与咔唑、二噁英等类似而常常作为高分子量PAHs降解研究的模式化合物。微生物降解成为有效解决PAHs污染物危害的最佳选择,已有研究发现微生物降解PAHs大多是从环羟基双加氧酶（ring hydroxylating dioxygenases,Rhd）的羟基化反应开始的,该反应也是整个降解过程中的关键和限速步骤。因此,有关Rhd结构、功能以及与PAHs如何作用受到了广泛关注。本研究以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DN1为模式菌株,采用同源模建和分子对接等技术对荧蒽与酶蛋白Rhd的相互作用进行探究。首先利用基因敲除的方法分别构建了Rhd大小亚基的基因缺失突变菌株Δrhd A、Δrhd B和Δrhd AB,并测定了荧蒽诱导条件下野生型菌株和突变株的生长状况和降解效率。实验结果表明:培养7天,野生型菌株DN1对荧蒽的降解效率可以达到71.35%,而同等条件下突变菌株的生长和荧蒽降解情况因基因缺失而受到影响,基因rhd A较rhd B的缺失对荧蒽降解率的影响更加显著（降解率只有55.38%）。其次,本文利用RT-q PCR技术监测了野生型菌株DN1和三种突变菌株在荧蒽诱导下rhd基因及相关降解基因的实时表达。结果表明:在野生型菌株DN1中降解基因在荧蒽的诱导下均表达上调;当rhd A基因缺失时导致rhd B基因上调量减少,由此推测rhd B基因可能会受到rhd A基因缺失的影响;而在突变株Δrhd B中,基因rhd A的表达量似乎并不受到基因rhd B缺失的影响;由此可见,在菌株DN1降解荧蒽过程中起到真正催化作用的主要是基因rhd A。此外,添加不同的辅助因子培养菌株DN1及Δrhd A,发现Fe³⁺是Rhd A蛋白发挥作用的重要辅助因子。在此基础上对Rhd A蛋白进行了外源表达及纯化,借助荧光光谱测定了Rhd A与荧蒽间的关系,同时选择同源性为47%的4QUR为模板并利用同源建模技术和分子对接手段进一步探究Rhd A与荧蒽间的相互作用机制。荧光光谱结果表明:酶蛋白Rhd A与底物荧蒽间存在一定的相互作用。通过同源模建方法获得菌株DN1中Rhd A蛋白的三维晶体结构模型并对其进行分子动力学优化,Ramachandran图分析可知优先区域的氨基酸残基数为96.5%,允许区域的氨基酸残基数为2.3%,只有1.2%的氨基酸残基位于异常区域;Ramachandran图的分析结果表明酶蛋白Rhd A拥有合理的立体三维结构。分子对接结果表明:邻近Rhd A活性位点的基团主要是疏水性的氨基酸残基,在活性位点中单核铁原子可以与两个氧原子形成一个三角形的结构,且具有一个His217-His222-Asp372三联体结构。此外,荧蒽分子中的C₇和C₈原子是距离Rhd A中双氧分子最近的碳原子,并且可以与其周围的辅助氨基酸残基和辅因子发生一定的相互作用;通过测量原子之间的距离可知O₁-C₇和O₂-C₈原子之间的距离分别为3.77?和3.04?,因此C₇-C₈位点是最易于被激活后的氧原子进攻并发生羟基化反应的位置。结合前期研究获悉降解产物的分析预测了荧蒽在菌株DN1中的降解途径是通过在C₇-C₈位通过Rhd羟基化反应,降解形成了7,8-二氢二醇荧蒽,再在相应酶的催化作用下进一步分解为1-二氢苊酮和1,8-萘二甲酸苷,最终进入TCA循环。