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目的:
Oatp2是广泛分布于肝细胞基底膜上非常重要的内向型转运体。UA对肝脏的药理作用提示UA在肝脏中存在较高的药物浓度,但关于UA在肝脏中的摄取转运机制未见报道。本文通过Oatp2抑制剂PRA对UA在小鼠体内药代动力学的影响以及体外PRA对肝细胞摄取UA过程的影响,以明确Oatp2与UA的内在联系。为进一步推动UA药理学作用机制的深入研究提供理论与实验依据。
方法:
1、建立UA生物样本的RP-HPLC检测方法。
2、连续5天给小鼠灌胃Oatp2抑制剂PRA(10、50mg/kg)后腹腔注射UA,采用HPLC法测定不同时间点小鼠血浆及肝脏中UA的浓度。
3、应用:DAS2.1.1软件求算UA的主要药动学参数,并对不同组间药动学参数进行t检验和方差分析,以考察PRA对UA的药动学及其肝脏组织摄取的影响。
4、建立小鼠原代肝细胞的分离方法和小鼠肝细胞温孵悬液,在此基础上建立经PCN诱导小鼠肝脏细胞Oatp2高表达模型。以UA作为反应底物考察PRA对UA在PCN诱导的小鼠肝细胞中摄取转运的影响。
结果:
1、建立的血浆样本和肝脏样本RP-HPLC检测方法具有较高的灵敏度和专属性,RSD均小于15％,ACCU％均在85～115％的范围内,方法学考察结果符合生物样本分析的要求。经灌胃PRA(10或50mg/kg)处理后的小鼠腹腔注射给予UA,UA在肝脏中的药物浓度显著降低,血肝药浓度比分别是未处理前的1.33-1.74倍和2.38-3.40倍。统计分析小鼠血浆药物浓度和肝脏药物浓度的比值的结果表明,预先给予PRA50mg/kg、PRA10mg/kg组各时间点数据及与空白对照组数据间均有显著性差异,p＜0.05有统计学意义。
2、建立了成熟的小鼠原代肝细胞的分离方法和小鼠肝细胞温孵悬液,肝细胞产率为1.2 x107/肝,肝细胞活力和纯度均在80％以上,符合药物转运实验的要求。经PCN诱导组PRA的摄取量分别为1.97±0.37、3.35±0.28μg/mL显著高于未经PCN处理的空白肝细胞组(P＜0.05),提示PCN诱导肝细胞Oatp2高表达。经PCN诱导组UA的摄取量分别为2.11±0.35、3.73±0.41μg/mL显著高于空白肝细胞(P＜0.05)。并且加入PRA后经PCN诱导的肝细胞对底物药物的摄取量显著降低,经PCN＋PRA处理的肝细胞组UA的摄取量分别为1.42±0.31、2.81±0.55μg/mL。结果表明10μg/mL的PRA对Oatp2介导的UA摄取具有显著的抑制作用。
结论:
本实验建立RP-HPLC的检测方法稳定可靠,符合生物样本检测的要求。实验建立的小鼠原代肝细胞分离方法能满足本实验的要求。成功建立了小鼠在体诱导肝细胞高表达Oatp2的实验模型。研究结果显示Oatp2抑制剂PRA能显著抑制UA摄取入肝脏的研究提示PRA和UA可能相互竞争肝脏上Oatp2介导的转运通路。研究进一步确认肝细胞上Oatp2介导UA的摄取及PRA对其摄取抑制作用。提示Oatp2可能介导UA肝脏转运。