第一部分补肾法、疏肝法对超促排卵小鼠围着床期子宫内膜VEGFR-2下游血管通透(PI3K)信号通路的影响目的:本研究通过观察补肾法、疏肝法与超促排卵小鼠围着床期子宫内膜VEGFR-2下游血管通透(PI3K)信号通路的关系,探讨两法改善子宫内膜容受性的作用机制及异同。方法:将240只8~10周龄动情周期正常的昆明雌鼠随机分为正常组、模型组、补肾组、疏肝组四组,每组60只。除正常组外,各组小鼠造成Gn RHa控制性超促排卵模型(Gn RHa+HMG+h CG)。自造模第一天开始补肾组给予补肾助孕方,疏肝组给予逍遥丸混悬液,每日0.4 ml/30g体重灌胃,正常组给予同等容量蒸馏水灌胃,连续11天。正常组腹腔注射同等容量0.9%生理盐水。注射h CG当天16:00以雌雄2:1合笼,次日上午9:00观察阴栓,见阴栓记为孕D1,其余妊娠天数以此类推。分别于孕D2、D3、D4、D5、D6,小鼠断头取血,采用放射免疫法检测小鼠血清中E2、P含量;各组剩余小鼠留至孕D8,统计各组小鼠阴栓数、妊娠数、胚胎着床数;HE染色观察小鼠子宫内膜形态的变化;扫描电镜观察小鼠子宫内膜胞饮突表达;采用硝酸还原酶法检测子宫内膜组织中NO含量;免疫组化法检测子宫内膜ER、PR、VEGF、VEGFR-2、eNOS蛋白表达及定位;Westetn blot法检测子宫内膜ER、PR、VEGF、VEGFR-2、Akt、p-Akt、eNOS蛋白表达;采用实时荧光定量PCR法检测子宫内膜组织中VEGF、VEGFR-2、eNOS m RNA的表达。结果:1小鼠妊娠数、胚胎着床数与正常组相比,模型组小鼠妊娠数、胚胎着床数均下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,各中药组妊娠数增加,胚胎着床数增加,差异具有统计学意义(P<0.05);补肾组妊娠数、胚胎着床数较疏肝组增加,但差异无统计学意义(P>0.05)。2各组小鼠动情周期变化正常组小鼠阴道涂片存在规律性动情周期变化,表现动情周期正常为4~5天。模型组及各中药组小鼠在连续注射5天Gn RHa后动情周期变化消失,阴道脱落细胞涂片表现为大量的白细胞,均处于动情间期;h CG日小鼠阴道分泌物增多,阴道涂片镜下显示大量角化细胞,处于动情期。合笼后可见阴栓。3各组小鼠血清P、E2、P/E2水平变化血清P、E2、P/E2水平在正常组、模型组、补肾组、疏肝组四组中均随妊娠天数增加而升高。血清P值:组内比较:各组小鼠血清P值于孕D4、D5、D6与孕D2、D3比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较:孕D2~D6,与正常组比较,模型组P值降低,差异有统计学意义(P<0.05);孕D4~D6,与模型组比较,补肾组、疏肝组均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。孕D4,补肾组P值低于正常组及疏肝组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清E2值:组内比较:各组小鼠血清E2值在孕D4~D6与孕D2、D3比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较:D2~D6:模型组E2值均低于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05);孕D3~D6:与模型组比较,补肾组、疏肝组E2值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);孕D4、D5:疏肝组高于补肾组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清P/E2值:组内比较:各组小鼠血清P/E2值在孕D4~D6与孕D2、D3比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较:D2~D6:模型组P/E2值均低于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05);孕D2~D6:与模型组比较,补肾组、疏肝组P/E2值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);孕D4:疏肝组高于补肾组,差异有统计学意义(P<0.05)。4各组小鼠子宫内膜HE染色结果正常组小鼠子宫内膜呈动态性变化,HE染色显示孕D2~D6妊娠小鼠子宫内膜逐渐增生、增厚,子宫腺体变多、变长、弯曲,腺腔扩大,血管增多、增粗,基质细胞逐渐增生且在着床期(孕D4)后分化为蜕膜细胞,子宫内膜转化为蜕膜,蜕膜组织水肿,蜕膜细胞间隙增大。与正常孕D2~D6相比,模型组孕D2~D6子宫内膜发育滞后,内膜及腔上皮变薄,间质较致密,血管较少,腺腔小,腺体和间质发育不同步。各治疗组妊娠D2~D6均较模型组有所改善,接近正常组。正常组小鼠妊娠D4子宫内膜间质疏松,血管及腺体丰富,腺体弯曲,腺腔较大,内膜较厚,腺体与间质同步发育;基质细胞发生蜕膜化,蜕膜细胞间隙较大。模型组小鼠子宫内膜腺体发育不良,腺腔小而直,数量减少,血管较少,间质密度不一,部分间质较紧密,细胞体积小,部分间质疏松,表现为腺体与间质发育不同步。补肾组、疏肝组子宫内膜发育较模型组有明显改善,表现为腺体增多,腺腔大而弯曲,间质疏松,血管丰富。各组小鼠孕D2~D6子宫内膜厚度呈现逐渐增厚的趋势,孕D4厚度明显增加,与D2、D3比较均有统计学意义(P<0.05)。孕D2、D4、D5、D6:与正常组比较,模型组厚度降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,疏肝组、补肾组内膜厚度均增加,差异有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组比较差异无统计学意义(P>0.05)。孕D3各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。5各组小鼠子宫内膜表面胞饮突的变化正常组小鼠子宫内膜呈现胞饮突发育之前、发育中、成熟和退化四个阶段;孕D2子宫内膜表面可见纤毛细胞和具有微绒毛的无纤毛细胞,为胞饮突发育之前的子宫内膜;孕D3为胞饮突发育时,微绒毛细胞开始突出,微绒毛已变短;完全发育的胞饮突出现在孕D4,胞饮突表面光滑,突起明显,呈蘑菇状,顶端肿胀呈菜花样,微绒毛消失;孕D5的胞饮突退化,表面皱缩,形如瘪气球,微绒毛重新出现;孕D6子宫内膜表面膜状突起开始消失,微绒毛重新出现,量大,连成片,覆盖内膜表面,胞饮突完成退化。而在模型组,孕D3时子宫内膜表面已提前出现膜样突起,胞饮突发育不同步,大小不一,参差不齐,多为刚突出于内膜面的发育不完全的胞饮突;孕D4时胞饮突大小不等,多为退化的胞饮突;孕D5时基本为退化的胞饮突;孕D6尚可见个别未完全退化的胞饮突残存,内膜表面少见微绒毛。补肾组、疏肝组孕D2~D6胞饮突变化均较模型组各时点有所好转,变化趋势接近正常组。6免疫组化法检测妊娠D2~D6小鼠围着床期子宫内膜ER、PR、VEGF、VEGFR-2、eNOS表达部位及结果6.1 ER、PR的表达ER、PR在子宫内膜腔上皮、腺上皮细胞核及间质细胞核中均有表达,其中ER主要在腺上皮细胞核中表达,而PR则主要在间质细胞核中表达。ER、PR:组内比较:四组小鼠子宫内膜ER、PR孕D2~D6均呈峰形曲线表达,孕D2~D3 ER、PR的表达逐渐上升,妊娠D4(即小鼠胚胎着床当天)表达最强,妊娠D5~D6表达逐渐减弱。正常组ER、PR在孕D4与其他各妊娠时段比较差异均有统计学意义(P<0.05);正常组孕D5:ER高于孕D2,PR高于孕D2、D3,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组小鼠子宫ER、PR在孕D4与孕D2~D6各时段比较差异均有统计学意义(P<0.05),孕D5 PR高于孕D2、D3,差异有统计学意义(P<0.05);疏肝组ER、PR孕D4与其他各妊娠时段比较差异均有统计学意义(P<0.05);疏肝组ER孕D5、D6与孕D2、D4比较差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组ER、PR孕D4与孕D2~D6各时段比较差异均有统计学意义(P<0.05),补肾组ER、PR于孕D5、D6与孕D2、D4比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较:与正常组比较,孕D2~D6模型组小鼠子宫内膜ER、PR表达在同时段均降低,其中模型组小鼠子宫内膜ER在D2、D4、D5与正常组相应妊娠时点的ER比较差异有统计学意义(P<0.05);模型组PR在孕D3~D6与正常组相应妊娠时点的PR比较差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,孕D2~D6补肾组、疏肝组小鼠子宫内膜ER、PR表达在同时段均升高,且两组ER均在妊娠D2、D4、D5与模型组相应妊娠时点比较差异有统计学意义(P<0.05);两组PR在妊娠D4与模型组相应妊娠时点比较差异有统计学意义(P<0.05)。补肾组ER、PR的表达与疏肝组ER、PR表达在妊娠各对应时点比较差异均无统计学意义(P>0.05)。6.2 VEGF、VEGFR-2表达阳性颗粒呈现黄色或棕黄色颗粒,主要定位于小鼠子宫内膜腔上皮细胞、基质或蜕膜细胞的胞浆中,腺上皮表达微弱。四组小鼠VEGF、VEGFR-2表达随妊娠天数增加呈峰形曲线变化,各组小鼠孕D2~D3子宫内膜VEGF的表达逐渐上升,妊娠D4(即小鼠胚胎着床当天)表达最强,妊娠D5~D6表达逐渐减弱,各时点间比较均有统计学意义(P<0.05);模型组妊娠D4 VEGF表达最高,与孕D2、D6比较差异有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组VEGF在妊娠D4高于其余各时点的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。正常组小鼠子宫内膜VEGFR-2表达均在孕D4达高峰,与其余各时点比较差异均有统计学意义(P<0.05),孕D5~D6较孕D4逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组小鼠子宫内膜VEGFR-2表达呈D4最高,妊娠D5~D6表达逐渐减弱,较D2~D3比较差异均有统计学意义。补肾组、疏肝组孕D4与其余各时点比较均有统计学意义(P<0.05)。模型组与正常组VEGF、VEGFR-2表达的比较:妊娠D4、D5、D6模型组VEGF低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);其余各天模型组均低于正常组,但无统计学意义(P>0.05);妊娠3 d、D4模型组VEGFR-2低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);其余各天比较模型组均低于正常组,但差异无统计学意义(P>0.05)。补肾组、疏肝组与模型组VEGF、VEGFR-2表达比较:补肾组、疏肝组VEGF在妊娠D2~D6均高于模型组,其中孕D4的差异有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组VEGFR-2在妊娠D2~D6均高于模型组,其中孕D3、D4有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组之间VEGF、VEGFR-2各时点比较差异无统计学意义(P>0.05)。6.3 eNOS的表达eNOS在子宫内膜腺上皮、腔上皮及血管内皮细胞浆中表达,间质细胞浆内表达较弱。孕D2~D6各组小鼠子宫内膜内膜eNOS表达呈逐渐升高趋势,妊娠D4升高明显。正常组、补肾组:孕D4与其他各妊娠时段比较差异均有统计学意义(P<0.05);孕D5、D6与孕D2、D3的差异有统计学意义(P<0.05);孕D6高于孕D5,差异有统计学意义(P<0.05);模型组、疏肝组:孕D4与孕D2、D3、D6的差异均有统计学意义(P<0.05);孕D5、D6与孕D2、D3的差异有统计学意义(P<0.05);孕D6高于孕D5,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组相比,模型组孕D2~D6子宫内膜的eNOS表达均降低,相应比较差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组子宫内膜eNOS蛋白表达较模型组增高,妊娠D2~D6比较差异均有统计学意义(P<0.05);疏肝组子宫内膜eNOS蛋白表达较模型组增高,妊娠D2~D6比较差异均有统计学意义(P<0.05);孕D2、D4、D5疏肝组eNOS蛋白表达高于补肾组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。7 Western blot法检测子宫ER、PR、VEGF、VEGFR-2、p-Akt/Akt、eNOS蛋白表达ER、PR:组间比较:与正常组比较,孕D2~D6模型组小鼠子宫内膜ER、PR表达在各时段均降低,其中模型组小鼠子宫内膜ER在D2、D4、D5、D6与正常组相应妊娠时点的差异有统计学意义(P<0.05);模型组PR在孕D4、D5、D6低于正常组相应妊娠时点的PR,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,孕D2~D6补肾组、疏肝组小鼠子宫内膜ER、PR表达在各时段均升高,且均在D2、D4、D5、D6与模型组相应妊娠时点比较差异有统计学意义(P<0.05)。补肾组与疏肝组之间ER、PR在妊娠各对应时点表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。VEGF:组内比较:正常组、模型组、补肾组、疏肝组各组小鼠子宫内膜VEGF孕D2~D6均呈峰形曲线表达,孕D2~D3 VEGF的表达逐渐上升,妊娠D4(即小鼠胚胎着床当天)表达最强,妊娠D5~D6表达逐渐减弱。正常组孕D2~D6各妊娠时段之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组孕D4仅与孕D2、D3比较差异有统计学意义(P<0.05);疏肝组孕D4与孕D2、D3比较差异有统计学意义(P<0.05);补肾组孕D4与孕D2、D3、D5、D6比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较:与正常组比较,模型组D2~D6同时段均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,补肾组、疏肝组D2~D5同时段均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组之间各妊娠时段比较无统计学差异(P>0.05)。VEGFR-2:组内比较:正常组、模型组、补肾组、疏肝组各组小鼠子宫内膜VEGFR-2孕D2~D6均呈峰形曲线表达,孕D2~D3VEGF的表达逐渐上升,妊娠D4(即小鼠胚胎着床当天)表达最强,妊娠D5~D6表达逐渐减弱。正常组孕D2~D6各妊娠时段之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组孕D2~D6各妊娠时段之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);疏肝组孕D2~D6各妊娠时段之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组孕D2~D6各妊娠时段之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较:与正常组比较,模型组D2~D6同时段均降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,补肾组、疏肝组D3~D6同时段均升高,差异均具有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组之间各妊娠时段比较无统计学差异(P>0.05)。p-Akt/Akt:与正常组相应时段比较,模型组D2~D6各妊娠时段小鼠子宫内膜p-Akt/Akt均降低低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,补肾组、疏肝组D2~D6各妊娠时段均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组妊娠D2~D6与疏肝组各妊娠时段比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。eNOS:组内比较:孕D2~D6各组小鼠子宫内膜eNOS表达呈逐渐升高趋势。正常组孕D2~D6各妊娠时段比较,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组孕D2~D6各妊娠时段之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05);疏肝组、补肾组孕D4与D2、D3、D6比较差异均有统计学意义(P<0.05),与孕D5比较差异无统计学意义(P>0.05)。组间比较:与正常组比较,模型组D2~D6同时段均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组均接近但低于正常组,其中疏肝组D2、D6与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05),补肾组D2、D3、D6与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,补肾组、疏肝组D3~D6同时段均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。补肾组D4较疏肝组D4降低,差异有统计学意义(P>0.05)。8实时荧光定量PCR法检测子宫VEGF、VEGFR-2、eNOS m RNA表达VEGF:组内比较:四组小鼠子宫内膜VEGF基因m RNA均为D2~D3逐渐升高,在孕D4达到高峰,孕D5~D6逐渐减弱。正常组小鼠VEGF与孕D4与其他各时段比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组小鼠VEGF孕D4时与D2、D3、D6比较差异有统计学意义(P<0.05);孕D5高于孕D2,比较差异有统计学意义(P<0.05);疏肝组妊娠D4小鼠VEGF m RNA与其他各时段比较差异均有统计学意义(P<0.05);孕D5高于孕D2,差异有统计学意义(P<0.05);补肾组孕D4较D2、D3、D5、D6小鼠VEGF m RNA升高,有统计学差异(P<0.05)。组间比较:模型组与正常组各妊娠时段比较,孕D2~D6小鼠子宫内膜VEGF m RNA均降低,均具有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组与模型组比较,孕D2~D6小鼠子宫内膜VEGF m RNA均升高,其中孕D2~D4、D6比较差异有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组各妊娠时段对应比较差异均无统计学意义(P>0.05)。VEGFR-2:组内比较:四组小鼠子宫内膜VEGFR-2 m RNA均为D2~D3逐渐升高,在孕D4达到高峰,孕D5~D6逐渐减弱。正常组小鼠VEGF于孕D4与其他各时段比较差异均有统计学意义(P<0.05),孕D5、D6高于孕D2且差异均具有统计学意义(P<0.05);模型组小鼠VEGFR-2孕D4时与D2、D3、D5、D6比较差异有统计学意义(P<0.05);孕D5、D6高于孕D2,比较差异有统计学意义(P<0.05);疏肝组妊娠D4小鼠VEGFR-2 m RNA与其他各时段比较差异均有统计学意义(P<0.05);孕D5、D6高于孕D2,差异有统计学意义(P<0.05);补肾组孕D4较D2、D3、D5、D6小鼠VEGFR-2 m RNA升高,有统计学差异(P<0.05),孕D4、D5、D6间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较:模型组与正常组各妊娠时段比较,孕D2~D6小鼠子宫内膜VEGFR-2m RNA均降低,两组中孕D2、D4、D5相应比较差异具有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组与模型组比较,孕D2~D6小鼠子宫内膜VEGF m RNA均升高,其中孕D2、D4、D5比较差异有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组各妊娠时段对应比较差异均无统计学意义(P>0.05)。eNOS:组内比较:孕D2~D6各组小鼠子宫内膜eNOS m RNA呈逐渐升高趋势。正常组孕D4、D5、D6分别与D2、D3比较,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组D4、D5、D6分别与D2、D3比较,差异均有统计学意义(P<0.05);疏肝组、补肾组孕D4、D5、D6分别与D2、D3比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较:与正常组比较,模型组D2~D6同时段均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组均接近但低于正常组,其中补肾组D4、D5与正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,补肾组、疏肝组D2~D6同时段均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组D4、D5较疏肝组低,差异有统计学意义(P>0.05)。9各组小鼠子宫NO比较组内比较:各组小鼠子宫内膜NO含量在妊娠D2~D6呈持续上升的趋势。正常组孕D2~D6不同时段间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组D4、D5、D6分别与D2、D3比较,差异均有统计学意义(P<0.05),孕D4、D5之间比较差异无统计学意义(P>0.05);疏肝组、补肾组孕D4与D2、D3、D6进行比较,差异均有统计学意义(P<0.05),孕D4、D5之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。组间比较:与正常组比较,模型组D2~D6相对应妊娠时段均降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);补肾组、疏肝组均接近但低于正常组,其中疏肝组孕D5与正常组孕D5比较差异有统计学意义(P<0.05),补肾组孕D2~D6与正常组孕D2~D6对应时段比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,补肾组、疏肝组D2~D6同时段均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);补肾组各妊娠时段均低于疏肝组对应时段,差异有统计学意义(P>0.05)。结论:1控制性超促排卵使围着床期小鼠子宫内膜容受性降低,导致妊娠率及胚胎着床率下降。2补肾法、疏肝法均能提高围着床期小鼠血清雌孕激素水平,上调子宫内膜ER、PR的表达,对子宫内膜形态、胞饮突形态和数量均有改善,从而有利于子宫内膜容受性的提高,但两法之间差异不明显。3控制性超促排卵小鼠围着床期子宫内膜eNOS表达及NO含量降低,使子宫内膜血管通透性降低。4补肾法、疏肝法能够上调围着床期小鼠子宫内膜VEGF表达,促进Akt活化,进而上调eNOS、NO的表达,提示补肾法、疏肝法对PI3K/Akt信号通路相关指标Akt、p-Akt及通透相关指标eNOS有影响,通过增加血管通透性,达到改善子宫内膜容受性,提高妊娠率的作用。在增加血管通透性方面,疏肝法优于补肾法。第二部分补肾法、疏肝法对人子宫内膜微血管内皮细胞VEGFR-2下游血管通透(PI3K)信号通路的影响目的:第一部分研究发现,补肾法、疏肝法能够增加VEGF的表达,促进Akt活化,进而上调eNOS、NO的表达,提示补肾法、疏肝法对PI3K/Akt信号通路相关指标Akt、p-Akt及通透相关指标eNOS有影响,促进血管通透性增加,达到改善子宫内膜容受性的作用。本部分实验拟通过将补肾法、疏肝法应用于人子宫内膜微血管内皮细胞来进一步探讨及证实两法改善子宫内膜容受性的具体机制及环节。方法:1对常规传代人子宫内膜微血管内皮细胞进行VEGF(40ng/ml)刺激,Real time PCR及Western blot法检测VEGF刺激不同时间点的VEGFR-2、eNOS、Akt、p-Akt的表达,用硝酸还原酶法检测不同时间点细胞上清中NO含量。2以VEGF(40ng/ml)刺激细胞12h,2%补肾助孕方、2%逍遥丸人含药血清预孵育细胞24小时,检测正常组、VEGF刺激组、补肾助孕方组、逍遥丸组各组中VEGF、VEGFR2的蛋白和m RNA水平。3常规传代内皮细胞,2%正常人低血清培养24h后,分别给予补肾助孕方和逍遥丸预孵育细胞24小时,再给予VEGF(40ng/ml)刺激内皮细胞24小时,Western blot法检测eNOS、p-Akt、Akt)的蛋白表达。4传代内皮细胞,低血清培养24h后,给予补肾助孕方和逍遥丸预孵育细胞24小时,再用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预孵育细胞2h,再给予VEGF(40ng/ml)刺激30min,Western blot法检测PI3K/Akt信号通路的变化。给予VEGF(10ng/ml)刺激12h,Western blot法检测通透性相关指标eNOS。结果:1 VEGF刺激细胞不同时间点对VEGFR-2、eNOS、NO表达的影响VEGF刺激细胞12h时细胞内VEGFR-2、eNOS蛋白水平及其m RNA,细胞上清NO含量升高最明显,高于0h、6h、24h时间点的实验组,蛋白表达差别有统计学意义(P<0.05)。VEGF作用于人子宫微血管内皮细胞在30min时Akt活性明显高于0min、15min、60min,比较差异有统计学意义(P<0.05)。2补肾法、疏肝法作用于人子宫内膜微血管内皮细胞对VEGF及VEGFR-2的影响与VEGF刺激组比较,补肾助孕方组、逍遥丸组的VEGF、VEGFR-2的蛋白及m RNA表达均增加,差异有统计学意义(P<0.05);补肾助孕方组与逍遥丸组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3补肾法、疏肝法对VEGF刺激人子宫内膜微血管内皮细胞Akt、eNOS的影响与VEGF刺激组比较,逍遥丸组、补肾助孕方组的eNOS、Akt蛋白表达均增加,差异有统计学意义(P<0.05),逍遥丸+VEGF刺激组、补肾助孕方+VEGF刺激组较VEGF刺激组的eNOS、Akt蛋白表达均增加,差异有统计学意义(P<0.05);逍遥丸+VEGF刺激组eNOS、Akt蛋白表达较逍遥丸组增强、补肾助孕方+VEGF刺激组的eNOS、Akt蛋白表达较补肾助孕方组增强,差异均有统计学意义(P<0.05);逍遥丸组的eNOS表达高于补肾助孕方组,差异有统计学意义(P<0.05),两组之间Akt的表达无统计学意义(P>0.05)。逍遥丸+VEGF刺激组的eNOS表达高于补肾助孕方+VEGF刺激组,两组之间差异有统计学意义(P<0.05),而细胞中Akt的表达两组差异无统计学意义(P>0.05)。4添加抑制剂LY294002前后补肾法对人子宫内膜微血管内皮细胞Akt、eNOS的影响VEGF组、补肾助孕方组、补肾助孕方+VEGF组的p-Akt、eNOS蛋白表达均比正常组增加,差异有统计学意义(P<0.05);补肾助孕方组较VEGF组的p-Akt、eNOS蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。人子宫内膜微血管内皮细胞中,VEGF刺激组p-Akt、eNOS蛋白表达为正常组的1.4倍、17倍,补肾助孕方+VEGF组的p-Akt、eNOS蛋白表达为正常组的2.4倍、37倍,其差异均具有统计学意义(P<0.05);加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后,抑制剂+VEGF组与VEGF组比较:p-Akt、eNOS蛋白表达分别为0.03 vs 0.07,0.02 vs 0.34,补肾助孕方+抑制剂+VEGF组与补肾助孕方+VEGF刺激组比较:p-Akt、eNOS蛋白表达分别为0.04 vs 0.12,0.02 vs 0.74,即抑制剂+VEGF组与VEGF组比较、补肾助孕方+抑制剂+VEGF组与补肾助孕方+VEGF刺激组比较,p-Akt、eNOS蛋白表达均降低,其差异有统计学意义(P<0.05)。5添加抑制剂LY294002前后逍遥丸对人子宫内膜微血管内皮细胞Akt活化及eNOS蛋白表达的影响VEGF组、逍遥丸组、逍遥丸+VEGF组的Akt、eNOS蛋白表达均比正常组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。逍遥丸组较VEGF组的p-Akt、eNOS蛋白表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF刺激组p-Akt、eNOS蛋白活化水平为正常组的3.1倍、2.9倍,逍遥丸+VEGF组的p-Akt、eNOS蛋白表达为正常组的9.2倍、7.9倍,其差异均具有统计学意义(P<0.05);加入PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后,抑制剂+VEGF组与VEGF组比较:p-Akt、eNOS蛋白表达分别为0.06 vs 0.25,0.11 vs 0.38,逍遥丸+抑制剂+VEGF组与逍遥丸+VEGF刺激组比较:p-Akt、eNOS蛋白表达分别为0.06 vs 0.74,0.12 vs 1.03,即抑制剂+VEGF组与VEGF组比较、逍遥丸+抑制剂+VEGF组与逍遥丸+VEGF刺激组比较,p-Akt、eNOS蛋白表达均降低,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾法、疏肝法能够增加VEGF的表达,激活PI3K/Akt信号通路,上调靶基因eNOS表达,从而促进血管通透性增加,达到改善子宫内膜容受性的作用。疏肝法在提高血管通透eNOS方面优于补肾法。