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能源短缺、原油价格上涨是全球关注的问题之一,生物柴油作为一种优质的液体燃料替代品应运而生。微藻具有生长速率快、油脂含量高、不受季节限制、不占用耕地等优势,被认为是制备生物柴油最有应用潜力的原料。为了实现工业化生产,应进一步降低生产成本。通过遗传修饰改造产油藻株,提高其产油性状,对于降低成本具有重要意义。本文针对一种硅藻—三角褐指藻进行遗传突变,获得含油量提高、脂肪酸不饱和度降低的突变株,其主要研究内容和结果如下:
第一,三角褐指藻随机插入突变体库的构建。以基因枪法对三角褐指藻进行转化,将外源抗性基因shble插入其核基因组,构建了一个含有5500个转化子的突变体文库。PCR检测结果表明突变体库的阳性率达97.5%,Southernblot检测验证了抗性基因的随机插入。
第二,尼罗红染色测定藻细胞中性脂方法的优化。研究了利用尼罗红荧光测定藻细胞中性脂相对含量的检测条件,发现在细胞浓度为6×105cells/mL-2.7×106cells/mL范围内,以20%乙醇处理,经过10min染色,中性脂荧光值与叶绿素a荧光值比值与藻株的甘油三酯含量呈相关关系。
第三,油含量突变藻株的筛选。通过多轮筛选从突变体库中获得2个高产油(3-1667和4-2411)和2个低产油藻株(3-2734和4-2560)。3-1667和4-2411总脂含量比野生型分别提高了7.87%和8.24%,甘油三酯含量分别提高4.58%和4.69%;3-2734和4-2560总脂含量分别降低11.78%和6.66%,甘油三酯含量分别降低7.87%和3.76%。这一结果表明,在三角褐指藻中可以通过随机插入突变来获得产油性状改良的藻株。
第四,4株产油藻株生长情况和脂肪酸组成的比较和分析。2株低产油株相比野生型生长缓慢,在稳衡期不饱和脂肪酸含量比野生型高。2株高产油突变株与野生型的生长速率一致,其中突变株3-1667无论总脂或甘油三酯中不饱和脂肪酸比例都比野生型增加,特别是甘油三酯中C20∶5(EPA)的含量可达野生型的2倍,适合用于EPA的生产。突变株4-2411甘油三酯中EPA含量明显比野生型下降,多不饱和脂肪酸比例不到1%,适合作为生物柴油的原料。