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1975年，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)作为一种独特的细胞毒性淋巴细胞首次在鼠体内被发现。人NK细胞通常定义为CD3-CD56+大颗粒淋巴细胞，是机体防御体系的第一道屏障，是机体抗肿瘤、抗感染及免疫调节的重要武器。NK细胞不同于T、B淋巴细胞，可直接杀伤靶细胞，不需要抗原预先致敏，无MHC限制。NK细胞主要通过两种途径介导细胞毒作用：①胞吐穿孔素及颗粒酶，其中穿孔素是NK细胞抗肿瘤过程中关键的效应分子，②Fas—FasL和TRAIL—TRAIL—R介导的细胞凋亡。
骨髓造血干细胞移植(BMT)与外周血造血干细胞移植(PBSCT)的研究结果表明，NK细胞与T细胞是介导GVL效应的主要淋巴细胞。T细胞杀伤肿瘤细胞的同时往往伴随GVHD的发生，而NK细胞杀伤肿瘤细胞的同时并不增加GVHD的发生率，近年研究结果显示：骨髓、外周血异源反应性NK细胞介导了重要的GVL效应，能有效降低移植后恶性疾病的复发率。
近几年，由于来源广泛，采集方便，冻存和复苏技术较为成熟，脐血已成为干细胞新的重要来源。虽然脐血T细胞表型较幼稚，功能较弱，但临床研究发现脐血移植(UCBT)后白血病与恶性病的复发率并不高，甚至低于BMT，由此推测脐血NK细胞可能也介导了有效的GVL效应。不少学者提取脐血单个核细胞(MNC)进行NK细胞功能的评价，发现脐血新鲜MNC细胞的细胞毒活性低下，但在细胞因子的刺激下其细胞毒活性明显增强，甚至与外周血MNC的细胞毒活性相当，然而，由于NK细胞仅占了MNC中的小部分，且细胞因子对T细胞及单核细胞都有刺激作用，单个核细胞的研究结果并不能准确反映脐血NK细胞的特性。IL—2、IL-15是提高外周血NK细胞功能很有效的两种细胞因子，然而其对脐血、骨髓纯化NK细胞的影响及影响机制还有待进一步研究。本实验拟比较免疫磁珠纯化后脐血与骨髓NK细胞的自发性细胞毒活性，并探讨IL—2、IL-15对脐血、骨髓NK细胞杀伤功能的影响及穿孔素在其中的作用，有利于更全面、准确地评价脐血NK细胞的生物学特性，为脐血的临床应用提供更丰富的基础理论依据。
材料和方法：
1.标本来源
脐血(CB)：本院健康足月妊娠产妇经产道或剖宫产分娩之胎儿脐静脉血，用含枸橼酸钠抗凝剂的一次性无菌采血袋收集，采血量70-100ml，共5份。
骨髓(BM)：健康青年志愿者骨髓，用肝素抗凝无菌离心管收集，标本量35-40ml，共4份。
K562：人红白血病细胞株，由中山二院脐血库保存的细胞株复苏培养。
Jurkat：人急性T淋巴细胞性白血病细胞株，购自中山大学肿瘤防治中心实验室。
2.实验方法
2.1单个核细胞(MNC)的分离
采用Ficoll—Hapaque分离法，流式检测MNC中CD3-CD56+细胞含量。
2.2 CD3-CD56+细胞的分选
采用免疫磁珠法分选，分选后流式检测CD3-CD56+细胞纯度及穿孔素表达率。
2.3新鲜纯化NK细胞的细胞毒活性检测
用LDH释放法检测CB/BM新鲜纯化NK细胞的细胞毒活性。
2.4细胞培养
2.4.1 NK细胞的培养及集落计数
CD3-CD56+细胞按每孔1.5×106个细胞接种于24孔板，采用含10％FCS的1640培养基培养，每孔终体积2ml，按照细胞因子组合的不同分为A组IL—2(40ng/ml)，B组IL—2(40ng/ml)+IL-15(20ng/ml)，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养，2天半量换液，全量补充细胞因子，培养至满3天。
培养满3天，观察CB/BM纯化NK细胞集落形成情况，选取约50个细胞组成的集落为基数，进行集落计数。
2.4.2细胞株的培养
K562、Jurkat细胞悬浮于含10％FCS的1640培养基中，按适当浓度接种于底面积为25c㎡的培养瓶中，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养，传代后12～36小时用于实验。
2.5培养后A/B组NK细胞的细胞毒活性检测
按照Promega公司CytoTox96 Non—Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒的说明书，先进行靶细胞数的优化。
2.6 A、B组NK细胞培养后流式检测穿孔素表达率。
2.7统计学处理
采用SPSS16.0软件包处理，数据描述采用均数±标准差，组内比较用配对资料t test，穿孔素表达率与细胞毒活性相关性分析采用Pearson相关，其余数据采用两独立资料t test，显著性差异为P＜0.05。
结论：
1、脐血/骨髓NK细胞对K562、Jurkat细胞均有杀伤作用。新鲜纯化与IL—2组脐血NK细胞的杀伤活性低于骨髓NK细胞。
2、脐血/骨髓NK的穿孔素表达率相当。
3、同剂量IL—2刺激对脐血NK细胞毒活性的提高程度比骨髓NK细胞明显。
4、促进穿孔素的表达是IL—2提高NK细胞细胞毒活性的一个重要途径。
5、IL—2可提高脐血/骨髓NK细胞的细胞毒活性。IL-15+IL—2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL—2。