金雀根中类雌激素成分的筛选与作用机理的研究

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金雀根提取物中的活性部位(extract of Caragana sinica,ECS)具有微弱的雌激素样作用,该文筛选ECS中具有类雌激素作用的有效成分,对其作用机制作进一步研究.为其应用于临床提供药理及分子生物学依据.一.金雀根中类雌激素成分的筛选及促细胞生长作用的研究.采用细胞增殖实验,以人乳腺癌MCF-7细胞为靶细胞,从ECS中筛选具有类雌激素样作用的成分.对细胞增殖实验加以改进;构建雌激素受体(estrogen receptor,ER)反义RNA表达质粒(pCASER),转染人乳腺癌MCF-7细胞,降低MCF-7细胞中ER的表达水平,筛选稳定转染ER反义核酸的MCF-7细胞-MTASER,同时以MCF-7和MTASER为靶细胞进行细胞增殖实验,比较有效成分对两种细胞增殖的影响.二.Miyabenol C和Kobophenol A对雌激素受体的影响.为了对Miy C和Kob A的雌激素受体的影响.为了对Miy C和Kob A的雌激素样作用进行进一步研究.利用放射性配体竞争结合实验检测Miy C和Kob A与ER的结合能力.利用报告基因检测实验研究Miy C和Kob A对ER活性的影响.利用蛋白免疫印记技术及半定量RT-PCR技术检测它们对ER蛋白质对RNA水平的影响.三.Miyabenol C和Kobophenol A防治骨质疏松作用机制的初步研究.为了研究Miy C和Kob A的选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulators,SERMs)的性质及其在防治骨质疏松中的机制.运用MTT实验,检测它们对类成骨细胞和子宫内膜癌细胞增殖的影响;以及半定量RT-PCR技术检测它们对IL-6基因转录水平的影响.四.Miyabenol C和Kobophenol A与雌激素受体结合位点.为了探讨Miy C和Kob A与ER的结合部位,运用计算机辅助分子模拟,构建它们与ER结合的空间模型,找出结合位点,设计ER的两个突变体[M1ER(ERM517AG521D)和M2ER(ERE353GR394G)];运用PCR技术将ER与Miy C或Kob A的结合点进行突变.运用报告基因检测实验,检测Miy C和Kob A对突变的ER是否具有激活功能.
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