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目的:体内外模拟心肌梗死区缺血微环境,探讨EGb761对移植BMSCs的影响及其作用机制。
方法:应用Ficoll液密度梯度离心法,分离大鼠BMSCs,并纯化扩增;体外通过缺氧无血清处理BMSCs3h、6h、9h、12h和24h建立缺血模型(94％N2+5％C02+1％02).Hochest33258染色检测BMSCs核变化,流式细胞仪检测BMSCs细胞凋亡率,选择BMSCs凋亡最显著的时间点,实验分组如下:对照组、模型组、EGb761组(10、50、100、500、1000和2000μg/ml)。缺氧无血清处理后,Hochest33258染色检测BMSCs核变化,流式细胞仪检测BMSCs细胞凋亡率,Western Blot检测Procaspase-3蛋白的表达,比色法检测MDA的含量、SOD的活性。选择EGb761对缺氧无血清诱导BMSCs凋亡最显著的剂量Western Blot检测Procaspase-8、Procaspase-9、Fas、Bcl-2、Bax、Bad、P-Akt和T-Akt蛋白的表达。PI3K通路抑制剂Wrotmannin预处理1h后,流式细胞仪检测BMSCs细胞凋亡率,Western Blot检测Procaspase-3蛋白的表达。
建立大鼠心肌梗死模型,经心外膜下直接注射经PKH-26标记的SD大鼠BMSCs作为移植供体细胞(1×105cells)。将上述动物随机分为5组:对照组、25ml/kg/d EGb761组、50ml/kg/d EGb761组、75ml/kg/d EGb761组100ml/kg/dEGb761组,每组5只,于术后7d取材。HE染色观察心肌梗死区及边缘区炎性细胞浸润,Tunel法检测梗死心肌中移植细胞凋亡情况。
结果:
1.缺氧无血清条件对细胞凋亡的影响。
Hoechst33258染色结果显示,缺氧前BMSCs细胞核染色均匀,发出蓝色荧光;缺氧后BMSCs细胞核皱缩,发出高亮度的蓝色荧光。流式细胞仪检测结果显示,与缺氧无血清处理前相比,缺氧无血清处理后BMSc的凋亡率显著增加,并随着缺氧时间的延长,BMSCs的凋亡率逐渐升高。
2.EGb761对缺氧无血清诱导BMSCs凋亡的影响。
Hoechst33258染色结果显示,正常对照组细胞核大而均质,发出淡蓝色荧光;凋亡模型组(Hypoxia/SD)及低剂量EGb761(10、50、100μg/ml)组细胞核皱缩,发出高亮度的蓝色荧光;而高剂量EGb761(500、1000、2000μg/ml)组细胞核似正常对照组,核大而均质,淡蓝染色。
流式细胞仪检测结果显示,与缺氧模型组相比,低剂量EGB761(10、50μg/ml)组BMSCs凋亡率显著增加,其中50μg/ml EGb761组BMSCs凋亡率增加最显著;100μg/ml剂量组BMSCs凋亡率变化没有统计学意义;高剂量EGB761(500、1000、2000μg/ml)组BMSCs凋亡率显著降低,其中1000μg/ml EGb761组BMSCs凋亡率降低最显著。Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,缺氧无血清处理后caspase-3前体蛋白表达量明显降低,与模型组相比,低剂量EGB761(10、50μg/ml)组Procaspase-3蛋白表达量显著降低,其50ug/mlEGb761组Procaspase-3蛋白表达量降低最显著;100μg/ml剂量组Procaspase-3蛋白表达量变化没有统计学意义;高剂量EGb761(500、1000、2000μg/ml)组Procaspase-3蛋白表达量显著增加,其中1000μg/mlEGb761组增加最显著。
3.EGb761对缺氧无血清诱导BMSCs氧化应激的影响
EGb761处理后,BMSCs中SOD活力显著增加,并随EGb761浓度的增加逐渐增强;EGb761处理后BMSCs中MDA含量显著降低,并随EGb761浓度的增加逐渐降低。
4.EGb761对缺氧无血清诱导BMSCs中凋亡蛋白变化的影响
Western blot检测结果显示,EGb761处理后BMSCs的bcl-2蛋白表达显著增加并随EGb761浓度的增加逐渐增强;EGb761处理后bax蛋白表达显著降低,并随EGb761浓度的增加逐渐降低。与正常对照组相比,缺氧无血清处理后,Procaspase-8和Procaspase-9蛋白表达量明显降低,Fas和Bad蛋白表达量显著增加,Akt发生去磷酸化;与模型组比较,低剂量EGb761处理后,Procaspase-9蛋白表达量明显降低,Procaspase-8蛋白表达量未发生显著变化,Fas和Bad蛋白表达量显著增加,Akt发生去磷酸化;高剂量EGb761处理后,Procaspase-8和Procaspase-9蛋白表达量显著增加,Fas和Bad蛋白表达量显著降低,Akt发生磷酸化。加入PI3K-AKT通路抑制剂wortmannin预处理后,低剂量EGb761处理组Procaspase-3蛋白表达量进一步降低,高剂量EGb761处理组Procaspase-3蛋白表达量降低。流式细胞仪检测结果显示,低剂量EGb761处理组BMSCs凋亡率进一步增加,而高剂量EGb761处理组BMSCs凋亡率显著降低。
5.心肌梗死区移植的BMSCs凋亡比率测定
结果与对照组比较,给予25mg/kg/d剂量EGb761组中移植的BMSCs凋亡比率增加;给予50mg/kg/d剂量EGb761组中移植的BMSCs凋亡比率无显著变化;给予75mg/kg/d剂量EGb761组和100mg/kg/d剂量EGb761组中移植的BMSCs凋亡比率显著降低。
结论:
1.缺氧无血清联合处理能较好的模拟模拟缺血心肌微环境,诱导BMSCs凋亡；
2.EGb761对缺氧无血清联合诱导BMSCs凋亡具有的双重剂量依赖效应；小剂量的EGb761可诱导的BMSCs凋亡,而大剂量的EGb761则抑制BMSCs凋亡,并且这种双重剂量依赖效应可能与Akt介导的线粒体信号通路相关;
3.EGb761对心肌梗死区移植的BMSCs凋亡也具有依赖的双重作用效应。