副溶血性弧菌是最为重要的食源性致病菌之一,同时也是世界范围内导致腹泻类疾病的主要原因之一。抗生素抗性基因在环境中传播扩散,导致的细菌耐药性问题更加剧了副溶血性弧菌的风险。研究副溶血性弧菌的分布情况、耐药性和遗传多样性,有助于更全面地掌握副溶血性弧菌的基本信息,可为副溶血性弧菌污染和耐药性的防控提供数据上的支持。因此,为更好地解决副溶血性弧菌耐药性的问题,本文进行了如下工作:(1)上海市水产品及其养殖环境中弧菌耐药性的研究;(2)上海市市售水产品中副溶血性弧菌耐药性及耐药基因不对应性分析;(3)上海市属医院临床分离的副溶血性弧菌毒力基因、耐药性与遗传多样性的研究;(4)上海市不同来源副溶血性弧菌耐药性比较研究;(5)多重与单一耐药的副溶血性弧菌在纯培养及南美白对虾中生长动力学参数比较研究。1.上海市水产品及其养殖环境中弧菌耐药性的研究本研究对上海市南美白对虾养殖场中弧菌的分布情况、耐药性和遗传多样性进行了普查,结果显示:养殖环境中副溶血性弧菌和霍乱弧菌检出率为100%,说明虾塘的弧菌污染相对严重。多位点测序分型分析结果显示:虾塘中副溶血性弧菌可分为28种ST型,新ST型的检出率高达92.9%,并存在2个大的克隆群CC1420和CC744。而霍乱弧菌可分为43个ST型,有41个ST型之前未被记载。说明虾塘中弧菌呈现出高度的遗传多样性。耐药性分析结果显示:弧菌的耐药性随养殖天数的增加而增强,耐药基因检出率也呈现相同的趋势。进一步分析虾塘水体、底泥和虾体中的耐药基因,发现水体中耐药基因种类较多,可能是导致弧菌耐性日渐升高的原因。本研究首次系统地监测了上海市虾塘中弧菌耐药性的动态变化情况,为有效地控制虾塘中弧菌的产生和传播提供了可靠的数据基础。2.上海市市售水产品中副溶血性弧菌耐药性及耐药基因不对应性分析本研究选择2009-2013年间上海市售水产品中分离的20株致病性副溶血型弧菌菌株作为研究对象,运用K-B纸片法和PCR技术分别分析了菌株的耐药表型和耐药基因型。耐药表型分析结果显示:对于18种常见的抗生素,20株致病性菌株中共有17株呈现出不同程度的耐药性,耐药率高达85%。其中,耐药率较高的抗生素分别为氨苄西林(85%)和头孢唑林(30%)。而携带tdh基因的致病菌,其耐药率明显高于携带trh的致病菌。耐药基因型分析结果显示:20株致病菌中共检测出8种抗生素抗性基因,分别为:str B、aad A2、str A、tet A、flo R、sul I、sul II和sul III。进一步研究发现,这些菌株的耐药表型和基因型呈现不对应现象:一部分对β-内酰胺类或氨基糖苷类抗生素具有抗性的菌株,并不携带相应的抗性基因;而另一部分携带氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类抗生素抗性基因的菌株,却并没有呈现出相应的耐药性。本研究首次系统地揭示了致病性副溶血性弧菌中耐药表型及耐药基因型不对应的现象,为后续细菌耐药性的研究提供科学的建议:应当重视敏感菌株携带抗生素抗性基因的现象,其有可能成为潜在的耐药风险源。3.上海市属医院临床分离的副溶血性弧菌毒力基因、耐药性与遗传多样性的研究本研究选择分离至上海市属医院中的42株副溶血性弧菌临床株作为研究对象,分析了这些菌株的毒力基因携带情况、耐药表型和耐药基因型,并通过MLST技术揭示了临床分离株的遗传多样性。结果显示:携带tdh的菌株是导致上海市居民感染副溶血性弧菌的最主要原因;临床分离的副溶血性弧菌耐药情况严重,多重耐药菌株的比率高达50%;副溶血性弧菌临床株呈现高度的遗传多样性,且衍生出多个新的变体;CC655为上海市副溶血性弧菌临床株的主导克隆群,在今后研究中应当给予高度的重视。4.上海市不同来源副溶血性弧菌耐药性比较研究本研究对150株不同来源的副溶血性弧菌,进行多位点测序分型和细菌耐药性分析,结果显示,养殖环节中副溶血性弧菌分离株与临床环节的分离株并无明显相关性。CC655为上海市副溶血性弧菌临床株的主导克隆群,零售环节可能是上海市副溶血性弧菌感染的主要源头。耐药性分析结果显示:临床分离的菌株的耐药性显著高于食品中分离的副溶血性弧菌,导致这一现象的原因可能是,耐药基因在人体肠道内发生了水平转移,导致了耐药性副溶血性弧菌的产生。5.多重与单一耐药的副溶血性弧菌在纯培养及南美白对虾中生长动力学参数比较研究。为了比较多重与单一耐药的副溶血性弧菌生长动力学参数的差异,探究―细菌耐药性‖与―风险‖之间的关联。本研究应用Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪结合梯度稀释法,比较了不同耐药程度的副溶血性弧菌在纯培养条件(TSB)下的最大比生长速率(μmax)。进一步分析选取耐药性最强的VPD18菌株(六重耐药)与耐药性相对较弱的VPD43菌株(只对氨苄西林具有耐药性)接种于南美白对虾中,构建不同温度下的生长曲线,采用Baranyi模型进行拟合得出生长动力学参数。结果显示:在纯培养条件下,多重与单一耐药的副溶血性弧菌的μmax间并无显著性差异(P>0.05)。而在南美白对虾中,单一耐药的副溶血性弧菌的μmax更大,但六重耐药的菌株却具有更短的延滞期(λ)。本研究为我国开展副溶血性弧菌的定量风险评估提供基础数据。