刺参生殖相关神经肽挖掘及特征研究

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本论文以刺参生殖发育相关神经肽的功能基因筛选及活性研究为核心,通过生物信息学分析、分子克隆、细胞水平的活性验证及生理功能评价,开展较为系统的研究探索,以期为刺参生殖发育的神经内分泌调控研究奠定基础。具体基于刺参基因组、转录组数据筛选到4条刺参生殖发育相关神经肽编码基因,并重点围绕刺参Kisspeptin神经肽,初步阐明了分子结构、活性特征及生理功能。主要研究成果如下:1、筛选获得4条刺参生殖调控相关的神经肽样蛋白编码基因序列(AjKisspeptin、NPS/CCAP型肽(NG)、F-likeSALMF(FS)、L-likeSALMF(LS))。其中刺参kisspepetin前体肽ORF区长543bp,预测编码180个氨基酸长度的前体肽,包含长23aa信号肽、两段长度分别为32aa(AjKiss1a(AGSLDcEDVERRGRQPNRNAHYRTLPF-NH2))和18aa(AjKiss1b(SAVKNKNKSRARPPLLPF-NH2))的成熟肽。预测其前体肽的等电点(pI)为4.90,分子量(Mw)为20.283 kD。通过荧光定量基因表达分析,初步研究了筛选得到的4个神经肽编码基因在刺参生殖发育过程中的时空分布变化规律,为后期生物学功能研究提供参考。2、运用细胞生物学研究手段,分析和阐明了1个刺参Kisspeptin成熟肽的活性特征。以实验室前期构建的刺参Kisspeptin受体融合表达载体(AjGPR54-EGFP)为基础,通过人工合成的刺参Kisspeptin成熟肽的运用,激活HEK293中表达的受体,并检测受体内吞及介导的胞内钙离子浓度和MAPK通路的ERK1/2磷酸化信号。研究结果证明人工合成的AjKiss1b-10(十肽)可以成功激活受体,说明预测的刺参Kisspeptin具有明显的生物活性。研究结果为进一步查明刺参Kisspeptin的生理功能奠定基础。3、通过体内外生理实验,初步查明刺参Kisspeptin成熟肽(AjKiss1b-10)的生理功能。研究通过基因表达分析、免疫荧光组织化学检测,查明Kisspeptin在生殖发育过程中具有明显的高表达特征,同时主要分布在刺参呼吸树、雄性性腺和神经环组织中;体外生理实验中,AjKiss1b-10可激活体外培养的卵巢细胞中的Kisspeptin受体并介导ERK1/2磷酸化;通过活体注射生理实验开展,证实AjKiss1b-10参与呼吸树和消化道器官功能调节,并导致消化道显著退化。研究结果说明Kisspeptin信号系统参与了刺参的生殖和代谢调控。
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