目的:本研究选择Notch信号配体Delta-like基因,建立稳定表达外源Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4骨细胞株,研究骨细胞Notch信号Delta-like类配体Dll1、Dll3及Dll4对骨髓基质细胞(Bone marrow Stromal cell,BMSC)成骨分化的影响,明确Notch信号Delta-like配体是否具有促成骨作用,以揭示骨细胞Smad4促进骨形成的分子机制。方法:(1)采用基因克隆技术制备慢病毒过表达Dll1、Dll3及Dll4基因的载体,将三个目的基因分别克隆至慢病毒过表达载体pLent-GFP-PURO-cmv(Flag)。(2)将慢病毒过表达载体与慢病毒包装系统质粒(psPAX2、pMD2.G)共转染293T细胞,获得的慢病毒原液感染MLO-Y4样骨细胞,嘌呤霉素筛选分别稳定表达Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4样骨细胞。并采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QPCR)对筛选出来的MLO-Y4样骨细胞中Dll1、Dll3及Dll4基因的表达进行鉴定。(3)将三种稳定表达Delta-like基因的MLO-Y4骨细胞株分别与野生型小鼠的BMSC进行共培养,采用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色及定量测定检测共培养3d ALP活性变化;QPCR检测共培养3d成骨相关标志基因及Notch信号靶基因的表达水平,并在使用Notch信号抑制剂DAPT后按照相同方法检测上述指标。结果:(1)琼脂糖凝胶电泳与测序结果显示三个目的基因Dll1、Dll3及Dll4分别成功克隆至慢病毒过表达载体pLent-GFP-PURO-cmv(Flag)上。(2)与阴性对照组相比,三个转染组中Dll1、Dll3及Dll4 mRNA的水平显著增加(P<0.05)。(3)与阴性对照组相比,共培养3d后骨细胞中Dll4基因的过表达促进了BMSC的ALP活性(P<0.05)。QPCR结果显示,MLO-Y4-Dll4组的ALP、Runx2、OPN及Collagen1成骨相关标志基因的表达均有所升高(P<0.05),Notch信号靶基因Hey1、Hey L、Hes1及Hes7的表达也有所升高(P<0.05)。而在加入DAPT后,MLO-Y4-Dll4组的ALP活性下降,成骨相关标志基因及Notch信号靶基因的表达有所下降(P<0.05)。结论:(1)建立了稳定表达外源Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4骨细胞株。(2)在骨细胞中过表达Dll4能促进BMSC的早期成骨分化,经典Notch信号通路的激活参与其中,揭示Dll4在骨细胞Smad4通过Notch信号促进骨形成中可能发挥了作用。