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目的 围孕期补充叶酸可以有效预防神经管畸形并提高子代认知表现,但孕中晚期是否有必要持续补充叶酸尚无定论。叶酸介导一碳单位代谢参与核酸合成和DNA甲基化,对中枢神经系统发育和功能至关重要。本研究采用大鼠生殖实验探讨孕期叶酸摄入对子代大鼠神经发育及学习记忆能力的影响,对孕中晚期补充叶酸的必要性进行探讨,为育龄女性合理补充叶酸提供理论依据;并初步探索其通过DNA甲基化影响神经发育过程及学习记忆能力的潜在机制。方法 将雌性SD大鼠分为:孕期叶酸缺乏组(FA-D)、孕期叶酸正常组(FA-N)、围孕期叶酸短期补充组(FA-S)和孕期叶酸长期补充组(FA-L)。收集母鼠外周血;子代新生鼠脑组织,同时体外培养海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs);部分子代鼠继续喂养至成年用于神经行为学检测。(1)血清叶酸检测:采用化学发光免疫法;(2)神经行为发育检测:采用触须定位反射、空中翻正反射、听觉惊愕反应、步态反射评价;(3)学习记忆能力检测:采用Morris水迷宫测试;(4)脑组织检测:透射电镜观察脑海马区超微结构;组织免疫荧光法检测神经元和增殖NSCs数量;western blots检测脑源生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、突触小泡蛋白(synaptophysin,SYP)表达;(5)体外培养新生鼠海马NSCs检测:采用Alamar Blue检测细胞活力,Brd U掺入和细胞免疫荧光法检测增殖和神经元分化潜力;(6)DNA甲基化检测:采用高通量Me DIP-chip检测分析筛选雄性子代新生鼠脑组织甲基化差异基因;结合KEGG通路富集分析筛选与神经发育过程和学习记忆能力相关的通路。结果1.大鼠孕期补充叶酸促进幼年子代大鼠触须定位反射、空中翻正反射、听觉惊愕反应、步态反射成熟;改善子代大鼠青少年和成年期的空间学习记忆能力和脑海马区超微结构。孕期长期补充叶酸在促进子代触须定位反射和步态反射成熟,提高子代青少年期和成年期空间学习记忆能力方面优于围孕期短期补充叶酸。2.大鼠孕期补充叶酸促进其子代出生时脑海马神经元产生和NSCs增殖。分离海马NSCs进行体外培养,补充叶酸组体外培养的NSCs活力、增殖能力均较高,诱导分化后神经元比例增高。孕期补充叶酸的子代出生时皮层神经元数量增多,BDNF、SYP表达增加。孕期长期补充叶酸在促进子代新生鼠海马神经元产生、NSCs增殖,提高体外培养的NSCs活力、增殖能力方面优于围孕期短期补充叶酸。3.高通量Me DIP-chip检测分析结果显示,母亲孕期叶酸摄入改变雄性子代新生鼠脑组织DNA甲基化谱,FA-D/FA-N组间调节干细胞多能性信号通络、自噬、紧密连接、钙信号通路、m TOR信号通路、Notch信号通路、神经营养因子信号通路、内质网蛋白加工通路、c GMP-PKG信号通路、缝隙连接、Rap1信号通路和胞吞通路发生差异甲基化。FA-L/FA-N组间调节干细胞多能性信号通络、自噬、紧密连接、钙信号通路、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、轴突导向通路、c GMP-PKG信号通路、缝隙连接、Erb B信号通路、谷氨酸能突触、神经活性配体-受体交互作用通路发生差异甲基化。结论 大鼠孕期补充叶酸,尤其是将围孕期补充叶酸的时间延长至整个孕期,促进子代大鼠神经行为发育,并提高其后期学习记忆能力,其机制可能与叶酸对脑海马区NSCs增殖、神经元分化,及皮层突触发育的促进作用有关,研究初步探索了基于DNA甲基化途径孕期叶酸影响子代大鼠神经发育过程及学习记忆能力的潜在机制。本研究为孕期合理补充叶酸提供理论依据,为后续相关机制的深入研究提供新思路。