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钙调蛋白(calmodulin,CaM)是一类小分子的单聚体钙离子结合蛋白,具有调控细胞增殖和凋亡、学习和记忆、信号通路交联、分泌和代谢以及肌肉收缩等生命活动的功能。脊椎动物有2-4个CaM基因,无脊椎动物一般则只有1个CaM基因,仅在海胆(Arbacia punctulata)中发现有两个CaM基因。花刺参与A.punctulata同属棘皮动物门,在进化上拥有独特的地位。研究花刺参CaM基因序列信息、分析花刺参CaM的表达特点有助于了解CaM基因的进化特点,对研究CaM在海参生命活动中所起的作用有重要意义。 首先,作者根据所在实验室之前获得的一段花刺参CaM(命名为StmCaM)的EST序列设计特异性引物,并结合RACE技术克隆得到了StmCaM cDNA全长序列。StmCaM cDNA全长1394bp,其中包括长138 bp的5UTR、806 bp的3UTR和450 bp的ORF。ORF推导出来的StmCaM含149个氨基酸(包括起始蛋氨酸),预测分子量约为16.7kDa,等电点为4.3。花刺参CaM同其他后生动物CaM相比同源性很高,与真海鞘(Halocynthia roretzi)、白氏文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum)、中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)的相似度最高(98%);与哺乳动物CaM的相似度最低(95.9%)。 随后,根据已克隆得到的StmCaM cDNA序列设计了5对特异性引物,并从花刺参纵肌束中提取总DNA。经PCR扩增、测序,得到StmCaM基因全长序列。StmCaM基因全长11852bp,和脊椎动物CaM基因一样含6个外显子和5个内含子。StmCaM基因内含子1、2、3、5与脊椎动物CaM基因内含子1、2、3、5的位置完全一致,仅内含子4出现一定偏离。 最后,选取了花刺参体壁、体腔液、呼吸树和肠四种组织,并利用real-timePCR检测StmCaM基因在其中的表达情况。Real-time PCR结果显示,StmCaM基因在呼吸树中表达量最高,其次是体腔液和肠;体壁中表达量最低,几乎检测不到。