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目的:人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在人群中普遍感染,具有潜伏-激活的感染特点。易在新生儿、器官移植及HIV等免疫力低下患者内激活引起严重并发症和后遗症,甚至造成死亡。HCMV具有严格的种属特异性,仅感染人,没有良好的动物模型,对潜伏激活的研究常通过细胞模型。本研究通过建立神经胶质母细胞瘤细胞T98G的HCMV潜伏再激活模型,收集潜伏和激活状态不同时间点的感染细胞进行转录组高通量测序。分析潜伏和激活感染状态转录水平存在显著差异的宿主细胞转录调控相关基因。探讨基因转录调控机制在HCMV感染再激活过程中的作用。为进一步探讨HCMV潜伏再激活机制提供实验依据。研究方法:1.建立HCMV感染T98G细胞潜伏模型:T98G细胞采用无血清饥饿法饥饿78h后,铺于150mm细胞培养皿中(2×10~6cells/dish),2小时内待细胞贴壁后以感染复数为10感染HCMV实验株Towne BAC,感染后16小时用PBS清洗一次并更换为全新的培养基。培养7天进行传代,传代过程中收集每代的细胞样品检测病毒基因组拷贝数及相关基因的RNA转录水平,收集细胞上清进行病毒滴度测定。第一代细胞定义为P0,依次为P1,P2,……PX。细胞里仍维持病毒基因组但上清无可检测性感染性病毒颗粒的感染细胞定义为潜伏感染细胞。2.建立HCMV潜伏感染T98G细胞再激活模型:潜伏细胞加入激活诱导剂cAMP/IBMX(使用终浓度100uM)后每4天换液,收集上清进行滴度测定,分别在诱导的第24小时、4天、8天、12天收集感染细胞。3.应用Illumina Hiseq4000测序平台对诱导不同时间的T98G细胞进行转录组高通量测序,使用HISAT进行参考基因组比对,使用Bowtie2软件进行参考基因比对,采用华大基因公司的Dr.Tom系统对测序结果分析。4.应用siRNA干扰技术干扰CEBPD的表达,验证CEBPD对HCMV再激活的作用。结果:1.成功建立了HCMV感染T98G的潜伏再激活模型。P7代T98G感染细胞中几乎无代表HCMV复制的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达,RT-PCR方法不能检测到HCMV的UL54、UL99等活动性感染基因mRNA的转录,未检测到感染细胞上清中的感染性病毒颗粒。以上结果表明成功建立HCMV潜伏感染的T98G细胞模型。潜伏感染的T98G细胞加入诱导剂4天,可见部分细胞中表达GFP,RT-PCR检测到UL54、UL82等基因mRNA转录,检测到感染细胞上清中的感染性病毒颗粒。表明T98G细胞中潜伏感染的HCMV被成功激活。2.细胞转录组高通量测序分析。与潜伏感染细胞相比,加入诱导剂后得到8367个细胞差异基因,富集到485个转录因子。诱导24小时的差异基因中转录因子CEBPD的m RNA表达显著上升。3.病毒转录组高通量测序分析。以HCMV Towne株(FJ616285.1)为参考,进行病毒基因比对。共比对上145个基因。上调的基因绝大多数为即可早期和早期基因。4.与DMSO对照组相比,加入诱导剂后PI3K-AKT通路中的p-AKT蛋白表达上调。5.应用siRNA干扰技术成功下调CEBPD蛋白表达,T98G细胞中潜伏的HCMV再激活现象受到抑制。结论:1.用cAMP联合IBMX对巨细胞病毒潜伏感染的T98G细胞诱导24小时,导致的细胞内的改变是人巨细胞病毒潜伏再激活的关键因素。2.通过cAMP联合IBMX诱导巨细胞病毒潜伏感染的T98G细胞24小时,导致的转录因子CEBPD的变化在病毒再激活过程中起促进作用。3.cAMP联合IBMX诱导巨细胞病毒潜伏感染的T98G细胞24小时,导致的PI3K-AKT通路中AKT的磷酸化增加可能在病毒再激活过程中发挥作用。