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鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是耳鼻喉喉头颈外科常见恶性肿瘤,好发于我国南方及东南亚地区。病因学研究表明,鼻咽癌的发病与EB病毒感染、遗传易感性、饮食习惯及某些环境理化因素有关,其发生也是一个多基因参与、多步骤的复杂过程,其中,EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)扮演重要角色。在EB病毒编码的众多蛋白当中,潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)是目前唯一证实的恶性转化基因。脱氧核酶(deoxyribozyme, DNAzyme,DZ)技术作为一种新型的基因治疗工具,能有效抑制目的基因表达,已广泛应用于肿瘤、病毒的基因治疗研究当中。本课题针对EBV-LMP1mRNA,设计并合成具有高效抑制性及特异性的脱氧核酶,观察其对鼻咽癌细胞及裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型中EBV- LMP1基因表达的抑制作用以及对鼻咽癌细胞产生的生物学影响,为鼻咽癌的预防和临床治疗提供新的基因治疗策略。第一部分脱氧核酶抑制鼻咽癌细胞EBV-LMP1基因表达的研究目的:根据前期研究结果,合成高效特异抑制EBV-LMP1基因表达的靶向脱氧核酶,并观察其对鼻咽癌细胞内靶基因的抑制效应。方法:以EBV-LMP1基因为抑制靶点,合成脱氧核酶DZ509(经前期细胞外分子水平切割筛选,证明具有高效性和特异性)、以及相对应的突变体mutDZ509(15nt碱基活性中心第4位点突变)和反义寡核苷酸ASODN509(有相同底物识别序列但无酶活性),5’端用FITC标记,并进行硫代化修饰,经脂质体分别转染C666-1细胞,命名为DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组。同时设立未转染空白对照组及仅转染脂质体对照组。转染后24h,荧光显微镜观察转染效率。采用RT-PCR、Western Blot方法检测其抑制LMP1mRNA和蛋白表达的效率。结果:转染后24h, DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组转染效率分别为64%、60%及65%。RT-PCR结果显示:与空白对照组相比,脂质体对照组对EBV-LMP1mRNA表达抑制率为5.94%,差异无显著性(P>0.05);而ASODN509、mutDZ509、DZ509都能不同程度抑制EBV-LMP1基因表达,其抑制率分别为23.33%、53.18%、68.76%,其抑制效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509,各组间比较,差异有显著性。其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05;DZ509组与ASODN509组相比, P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组相比,P<0.05。Western Blot检测结果与RT-PCR基本一致。与空白对照组相比,脂质体组对EBV-LMP1蛋白表达抑制率为1.68%,差异无显著性(P>0.05);ASODN509、mutDZ509、DZ509都能不同程度抑制EBV-LMP1蛋白表达,抑制率各为22.14%、50.39%、68.21%,其抑制效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509,各组间比较,差异有显著性。其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05; DZ509组与ASODN509组相比, P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组相比, P<0.05。结论:与mutDZ509、ASODN509相比,DZ509能高效抑制鼻咽癌细胞中EBV-LMP1基因表达,为进一步体内实验提供基础。第二部分EBV-LMP1靶向脱氧核酶对鼻咽癌细胞生物学特性的影响目的:探讨靶向脱氧核酶对鼻咽癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法:将脱氧核酶DZ509、相对应的突变体mutDZ509、无酶活性的反义寡核苷酸ASODN509经脂质体转染至C666-1细胞,分别命名为DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组。同时设立未转染空白对照组及仅转染脂质体对照组。转染后24h、48h及72h,采用MTT法检测各实验组细胞的增殖情况。转染后24h,采用流式细胞仪检测各实验组细胞的细胞周期;采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI检测各实验组细胞的凋亡情况。结果:MTT结果显示,转染后24h,与空白对照组相比,脂质体组细胞增殖抑制率为5%,差异无显著性(P>0.05); DZ509组、mutDZ509组和ASODN509组细胞增殖抑制率分别为31%、16%、14%,组间比较差异有显著性(P<0.05),抑制效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509。转染后48h, DZ509、mutDZ509、ASODN509对细胞增殖抑制明显减弱,抑制率分别为19%、7%和6%,其中,DZ509组与mutDZ509组、ASODN509组比较,差异有显著性(P<0.05);mutDZ509组与ASODN509组相比,差异无显著性(P>0.05)。转染后72h结果与48h基本一致。转染后24h,流式细胞仪检测C666-1细胞周期,结果显示:对于G0/G1期比率,与空白对照组50.28%相比,脂质体组为55.23%,差异无显著性(P>0.05);DZ509组为68.46%,差异有显著性(P<0.05)、mutDZ509组、ASODN509组分别为63.72%和62.23%,差异无显著性(P>0.05),其中DZ509组和mutDZ509组、ASODN509组比较,差异无显著性(P>0.05)。mutDZ509组与ASODN509组比较,差异无显著性(P>0.05);对于S期所占比率,与空白对照组39.30%相比,脂质体组为33.72%,差异无显著性(P>0.05);DZ509组为12.37%,差异有显著性(P<0.05);mutDZ509组、ASODN509组分别为27.05%和28.77%,差异无显著性(P>0.05),其中DZ509组和mutDZ509组、ASODN509组比较,差异有显著性(P<0.05)。mutDZ509组与ASODN509组比较,差异无显著性(P>0.05)。流式细胞仪检测并计算凋亡率,转染后24h,与空白对照组相比,脂质体组细胞凋亡率为0.48%,差异无显著性(P>0.05);DZ509、mutDZ509、ASODN509组细胞凋亡率约为16.64%、10.47%、8.81%,其凋亡诱导效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509,差异有显著性(P<0.05)。结论:较mutDZ509、ASODN509相比,DZ509能明显抑制鼻咽癌细胞增殖,使细胞生长停滞于G0-G1期,DNA合成减少,并诱导细胞凋亡。第三部分EBV-LMP1靶向脱氧核酶对裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤生长的影响目的:建立裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型;观察靶向脱氧核酶、突变脱氧核酶及反义寡核苷酸对移植瘤生长及LMP1表达的影响。方法:将鼻咽癌细胞C666-1种植于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况。成瘤后,将裸鼠随机分为DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组、PBS组,每组各7只,每天于瘤体内分别多点注射脱氧核酶DZ509、突变体mutDZ509、反义寡核苷酸ASODN509及对照PBS,观察并记录肿瘤生长情况。7天后处死裸鼠。剥离肿瘤组织,RT-PCR检测LMP1mRNA表达、Western Blot、免疫组织化学检测LMP1蛋白表达。结果:成功建立裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型。经DZ509、mutDZ509、ASODN509和PBS干预后, DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组、PBS组瘤体重量分别为(0.225±0.05)g、(0.4±0.08)g、(0.475±0.15)g、(1.125±0.25)g。与PBS组相比,DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组肿瘤重量均减轻、差异有显著性(P<0.05);DZ509组与mutDZ509组、ASODN509组比较,肿瘤重量减轻,差异有显著性(P<0.05);而mutDZ509组与ASODN509组比较,差异无显著性(P>0.05)。对肿瘤组织RNA行RT-PCR检测结果显示,以PBS组为对照,各组对LMP1mRNA表达的抑制效应:ASODN509<mutDZ509< DZ509,抑制率分别为19.34%、45.36%、62.89%,组间比较差异有显著性。其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05;DZ509组与ASODN509组比较, P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组比较, P<0.05。Western Blot检测结果显示,以PBS组为对照,各组对LMP1蛋白的抑制效应ASODN509<mutDZ509< DZ509,抑制率分别为18.45%、42.34%、63.13%,差异有显著性。其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05;DZ509组与ASODN509组比较, P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组比较, P<0.05。免疫组织化学结果显示:经DZ509、mutDZ509、ASODN509及PBS处理后,各组肿瘤组织切片LMP1阳性表达细胞占总细胞数比率分别为:21.8%、38.5%、52.5%、69.3%,其比例: DZ509<mutDZ509<ASODN509< PBS。与PBS组相比,DZ509组、mutDZ509组、ASODN509组LMP1蛋白表达减少,各组比较,差异有显著性。其中,其中,DZ509组与mutDZ509组相比,P<0.05;DZ509组与ASODN509组比较,P<0.01;mutDZ509组与ASODN509组比较, P<0.05。结论:靶向LMP1脱氧核酶DZ509在裸鼠体内能明显抑制移植瘤的生长,抑制LMP1mRNA及蛋白表达,有望成为治疗鼻咽癌有效的基因药物。