第一部分应用IL-1受体阻断剂和骨保护素联合基因治疗无菌性假体松动作用和机制的体外研究研究背景近年来随着人们生活水平的提高,肥胖和老龄化带来的一些疾病日益受到重视,比如晚期骨性关节炎,该病不仅给患者带来痛苦,晚期关节畸形使患者丧失行动能力,严重影响患者的生活质量。伴随人工关节技术的发展,关节置换手术对此难题迎刃而解,成为目前对严重关节系统疾病的常用治疗方式。然而关节置换手术术后十年并发无菌性假体松动的发生率高达34%。无菌性假体松动发生后需行关节翻修手术,因关节翻修术创伤大难度高,不仅给患者带来手术痛苦,也对实施手术的临床医师提出了更高的技术要求。基于目前关节置换手术的广泛开展和无菌性假体松动是关节置换术后最常见的并发症,越来越多的研究也在聚焦对无菌性假体松动的干预和治疗。因关节特殊的解剖构造,通常全身用药往往很难维持关节周围较高的药物浓度,通过关节腔注射往往又对无菌性操作有很高的要求,而且该操作为有创操作,给病人带来较大的痛苦,且无菌性假体松动是一个慢性进行性发展的疾病,治疗周期较长,病人常难以耐受数年的治疗。如何采取一种给药方式,能长期高效的维持局部的药物浓度,又不至于引起全身血药浓度的升高,引起不良反应。基因治疗提供了一个很好的方法,通过对关节周围组织的基因转染,使局部组织能持续高效表达治疗基因,从而达到持久高效维持局部药物浓度的目的。无菌性假体松动的病理过程复杂,具体发生机制尚未完全阐明,但大部分研究表明假体周围机械磨损产生的生物颗粒在无菌性假体松动的发生发展中扮演着重要的作用。关节假体因机械活动中产生磨损颗粒,磨损颗粒一方面本身作为异物刺激机体产生炎症反应,另一方面磨损颗粒也会对其周围的软组织的产生机械性损伤,受伤的组织也会诱发局部的炎症反应。因局部炎症反应释放IL-1、TNF等大量炎症介质,导致巨噬细胞活化并一步释放大量炎症介质,一方面活化的巨噬细胞加强对磨损颗粒异物的吞噬,然而人工关节常为金属材料、高分子材料和陶瓷材料,这些材质的磨损颗粒在被巨噬细胞吞噬后往往不能被消化,残留的磨损颗粒继续诱发炎症的恶化,另一方面炎症因子促使大量破骨细胞生成,造成假体周围骨溶解的加重,进一步导致了假体松动的发生,随着假体松动的加重,假体与骨组织的机械磨损进一步加重,产生更多的磨损颗粒,磨损颗粒诱发更严重的炎症和骨溶解。综上所述,整个病理过程呈现一个恶性循环。基于此我们提出假说：炎症和骨溶解在无菌性假体松动的发生发展中既是-个相互联系又是一个相互区别的过程。根据这个假说我们提出联合应用IL-1受体阻断剂和骨保护素(OPG)基因治疗无菌性假体松动并初步探讨无菌性假体松动的病理发生机制。目的通过体外实验联合应用IL-1受体阻断剂和骨保护素(OPG)基因治疗抑制RAW细胞活化：一是研究联合应用抗炎和抗骨溶解对无菌性假体松动治疗的可行性,二是观察两者是否具有协同效果,是否优于相同剂量的单独治疗组,三是进一步探讨无菌性假体松动病理发生机制材料与方法1.细胞培养活化及基因转染采用RAW264.7细胞株,将RAW细胞(2×104/m1)与钛颗粒悬浮液(1×106/m1)于37℃,5%C02培养箱共同培养(其中钛颗粒大小为2.3±0.618μ m,与关节假体松动后磨损颗粒大小相当),共同培养72小时后被随机分为5组：第一组为IL-1受体阻断剂单基因治疗组,在分组后立即转染800μl浓度为1×107pfu的编码IL-1受体阻断剂基因的逆转录病毒液；第二组为OPG单基因治疗组,转染浓度为107particles/ml编码OPG的腺相关病毒液,其转染时间为编码IL-1受体阻断剂的病毒转染后第3天,第三组为联合基因治疗组,其转染半剂量的编码IL-1受体阻断剂基因的逆转录病毒和编码骨保护素(OPG)的腺相关病毒；第四组为LacZ转染对照组,转染10’particles/ml编码LacZ的腺相关病毒液；第五组为空白对照组,无任何病毒转染。为提高联合基因的治疗时间,使retrovirus-IL-1Ra和AAV-OPG的基因表达达峰时间重叠,我们分别通过实验检测了retrovirus-IL-1Ra和AAV-OPG的转染效率,确定了在retrovirus-IL-1Ra转染后3天再转染AAV-OPG,每2天更换一次培养液,将各组每周的上清液收集在一起,经过总共4周的培养将细胞收获。2.酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎症介质IL-1在完成上述基因转染后,各实验组每周收取的上清液通过ELISA试剂盒进行检测炎症因子IL-1的释放量,利用紫外分光光度计在405nm波长处读出吸光度,绘制标准曲线,并根据标准曲线计算各实验组IL-1的浓度。3.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色染色检测破骨细胞RAW细胞经过基因转染和4周的培养收获,应用TRAP试剂盒对各治疗组进行TRAP染色,将浓度为1×106/ML的200μ l各基因转染组RAW细胞液被甩到组织片上,将片子浸在acetone中固定30秒,片子然后在在0.1M acetate buffer (pH5.2),包含0.5mM naphthol AS-BI phosphoric acid,2.2mM FastGarnet GBC,和lOmM sodium37℃孵育1h,经去离子水冲洗后停止反应封片。4. Real Time-PCR检测IL-1、RANK、TRAF6、JNK1、c-Fos、CPK基因的表达将基因转染后各实验组RAW细胞的RNA用TRIZOL试剂进行提取,逆转录反应中cDNA获取,从0.5mg的总RNA在40ml的反应混合液中进行反应,混合液包含1X PCR buffer,500mM的nucleotide triphosphates,0.5Uml-1o的ribonuclease inhibitor,2.5mM的random hexamers,5.5mM的MgCl2,和1.25Uml-1的reverse transcriptase。反应混合液按DNA在25℃作用10min,48℃作用5min,接下来95℃作用5min的模式下循环.应用ABI Prism7700机器对炎症因子IL-lb和信号分子RANK, c-Fos, TRAF6, JNK1,和CPK进行基因表达的检测5.统计学分析应用SPSS软件对各组数据进行T检验或方差分析多重比较,P<0.05表示有统计学差异。结果1.联合基因治疗的抗炎效果RAW264.7细胞(2×104)在体外与钛颗粒悬浮液(1×106)共同培养,然后用DFG-IL-1Ra-neo和AAV-GFP-OPG分别或联合转染,其中联合基因治疗组相比于单基因治疗组采用半剂量(0.4×104pfu)转染。107particles M-1的AAV-LacZ作为基因治疗对照组。酶联免疫吸附实验(ELISA)表明IL-1Ra基因治疗组和联合基因治疗组在第一周就表现抑制IL-1的释放,并且3周各治疗组均持续抑制IL-1释放,但后期OPG治疗组抑制效果稍差。4周培养获取的RAW细胞经RT-PCR检测明显降低了IL-1B的基因表达,且联合基因治疗组效果最佳。2.联合基因治疗在破骨细胞分化中的作用4周培养后获取的RAW细胞经酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,OPG和联合基因治疗组中TRAP阳性细胞明显减少,IL-1Ra治疗组效果稍差。虽然RAW264.7细胞系中多核细胞相对少,但TRAP染色的特性提示了破骨细胞分化成熟。RT-PCR也表明联合基因治疗组明显较低了RANK基因表达,暗示联合基因治疗具有良好的协同效果。3.基因治疗对破骨细胞分化中分子机制探讨应用RT-PCR对破骨细胞分化中信号分子进行检测,以LacZ为对照基准,在IL-Ra、OPG.联合基因治疗组中cFos分别降低了54%、67%、88%；TRAF6分别降低了25%、31%、44%；在联合基因治疗组和IL-1Ra组JNK1分别降低了20%、16%；OPG组变化不明显。联合基因治疗组CPK降低超过50%,相对单基因治疗组显示更好的效果。结论1. IL-1Ra和OPG联合基因治疗能有效抗炎,抑制炎症因子IL-1的释放。2. IL-1Ra和OPG联合基因治疗能明显抑制了破骨细胞分化。3. IL-1Ra和OPG联合基因治疗相比于单基因治疗组有更好的效果,提示两者有协同作用。第二部分利用无菌性假体松动小鼠模型对IL-1受体阻断剂和骨保护素联合基因治疗的研究研究背景无菌性假体松动作为关节置换术后最常见的远期并发症,有文献报告高达34%关节置换术后病人会发生无菌性假体松动。一旦发生假体松动,不仅给患者带来肉体上的疼痛,而且病情随着负重活动增加呈进行加重,最终会导致再次丧失行走能力。目前主要的治疗手段就是行关节翻修手术,因手术复杂、操作困难、费用高等局限,探求一种新的治疗方案来延缓或阻止无菌性假体松动的发生成为研究热点。在研究无菌性假体松动的过程中,选择和建立一种合适的动物模型成为重要内容。有文献报告选择狗、马、羊等大型动物用于模型创建,该模型优点在于：与人类关节尺寸类似,而且适合长期研究,缺点是：研究费用高,不易饲养,样本含量受限。也有采用air pounch小鼠模型模拟关节内环境,操作方便,但仅适于短期研究,且属于急性期损失病理变化。本研究项目前期通过对小鼠膝关节植入钛钉,并定期注射钛颗粒,成功创建了无菌性假体松动的小鼠模型,既解决了样本含量的受限,也适于长期研究的应用。无菌性假体松动的病理机制复杂,组织学显示假体周围常有炎性伪膜形成,大量炎性细胞浸润和假体周围骨溶解发生。多数学者认为假体磨损产生的颗粒是导致假体周围骨溶解,是人工关节晚期松动的主要原因。由于机械磨损产生的颗粒作为异物刺激局部发生炎症反应,活化巨噬细胞,释放大量IL-1、TNF、IL-6等炎症因子,炎症囚子进一步刺激成骨细胞、骨髓基质细胞等上调核激活因子KB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor NF-KB ligand, RANKL)的表达。近年研究发现,OPG/RANKL/RANK系统在骨组织代谢平衡中发挥重要的调节作用。RANKL与破骨细胞前体细胞表明RANK结合后,就会启动破骨细胞的分化生成,加重了局部骨溶解,骨保护素(OPG)可与RANKL竞争性结合RANK,但不激活破骨细胞生成,从而起到骨保护的作用,成为目前破骨细胞研究中应用较多的靶蛋白。在假体-骨界面的炎症修复过程中,肉芽组织大量形成并纤维化,使假体-骨界面之间形成一层伪膜,骨丢失与炎性伪膜的形成进一步加重了假体的松动,产生更多的磨损颗粒,使无菌炎症和骨溶解加重形成恶性循环。本研究早期已经充分认识到在无菌性假体松动发生发展过程中,炎症和骨溶解既相互区别又相互联系的病理过程。通过体外实验证明了应有IL-1受体阻断剂和OPG联合基因抑制炎症和破骨细胞生成的有效性,为探讨在体内复杂内环境下的联合抗炎和抗骨溶解的效果,进行了在小鼠无菌性假体松动模型上对IL-1受体阻断剂和OPG联合基因治疗的应用研究。目的1.建立适于长期研究无菌性假体松动的小鼠模型2.观察无菌假体松动的病理变化3.在无菌性假体动物模型复杂的内环境下应用IL-1受体阻断剂和骨保护素联合基因治疗,探讨联合抗炎和抗骨溶解的治疗效果和可行性。材料与方法1.小鼠无菌性假体松动模型的创建及基因转染24只10-12周BALB/c小鼠,实验开始前小鼠隔离2周,腹小鼠麻醉后无菌在无菌条件下,沿右髌韧带内侧做纵行切口,显露胫骨平台,刮除胫骨平台软骨,用直径0.7mm的钻头从胫骨平台中央垂直钻入约5mm,准备植入钛钉,在植入钛钉之前向胫骨髓腔注入10μ L钛颗粒悬浮液,术后立即进行X线拍片确定植入钛钉位置正确。术后每4周注射20μL钛颗粒悬浮液至关节腔。术后第3周随着无菌性假体松动发生随机分为4组,分别为IL-1Ra治疗组(6只),OPG治疗组(6只),联合基因治疗组(6只),LacZ对照组(6只)。将50μL和25μL含有DFG-IL-IRa的无菌培养液分别注入IL-1Ra治疗组。3天后将将50μL和125μ L含有AAC-OPG的无菌培养液分别注入OPG治疗组和联合基因治疗组,同时将50u L含有AAV-LacZ的无菌培养液注入LacZ对照组。基因治疗8周后处死小鼠,进行生物力学、组织学检测和Micro-CT扫描2. Micro-CT扫描所有小鼠在术后1周麻醉后行Micro-CT扫描确认钛钉位置良好,基因治疗8周后再次性Micro-CT扫描,应用MicroCT自带软件进行胫骨近端钛钉植入区进行三维重建,并计算获取骨密度,骨容积/总容积值。3.小鼠胫骨近端植入物生物力学检测基因治疗后8周处死小鼠,从假体关节处行膝关节离断,去除假体周围的软组织显露钛钉帽,将假体及胫骨通过牙科粉置于固定架上,假体钉帽置于固定架的夹持刀片中间,将固定架连接BOSE电子力学检测系统并进行牵拉,对输出的数据进行分析处理。4.组织学检测拔钉实验后收集胫骨近端的组织。应用福尔马林缓冲液固定,12%EDTA脱钙,石蜡包埋。苏木精.伊红(HE)染色后在光学显微镜下观察新生骨或者骨质破坏,并使用Image-Pro软件测量假体和胫骨之间伪膜的厚度。5.统计学分析应用SPSS软件包对实验数据进行t检验或方差分析及多重比较。p<0.05表示具有显著性差异。所有数值均用平均值±标准差表示。结果1. Micro-CT扫描基因治疗8周后采用Scanco Micro-CT系统对所有小鼠进行骨扫描,三维重建显示假体周围骨溶解在联合基因治疗组明显减少。通过对骨密度和骨容积/总容积比值的统计,治疗组相对于LacZ对照组均显示明显的治疗效果。2.联合基因治疗组对胫骨近端植入物机械力学检测因为假体周围骨溶解的发生会导致假体生物力学稳定性变差,因此基因治疗8周后,应用拔钉实验检测胫骨近端植入钛钉的稳定性。其中拔钉力线波峰代表钛钉从胫骨中被拔出一瞬间的力。虽然OPG治疗组数据波动较大,但仍显示良好的稳定性。相对于LacZ对照组,双基因治疗组显示明显的统计学差异。而IL-1Ra治疗组相对于LacZ对照组,虽有不同但并未显示统计学差异。(P=0.21)3.联合基因治疗组对骨重建的影响.胫骨近端切片HE组织染色,AAV-LacZ对照组可以观察到假体骨界面的伪膜明显较厚,而各治疗组的假膜组织较薄,具有统计学意义(p<0.05)。通过Image-pro对伪膜厚度进行定量分析统计,相对于LacZ对照组,OPG治疗组和联合基因治疗组明显抑制了伪膜的形成。结论1.成功创建了用于长期研究无菌性假体松动的小鼠模型。2.应用IL-1受体阻断剂和OPG联合基因治疗在体内复杂的内环境下成功地抑制了局部炎症反应和骨溶解,增加了植入物的稳定性。3.IL-1受体阻断剂和OPG联合基因治疗对无菌性假体松动的治疗具有协同效果,优于单基因治疗组。