嗜水气单胞菌主要外膜蛋白免疫原性分析及其基因克隆与表达

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本研究选取鳗源嗜水气单胞菌L316和参考菌株嗜水气单胞菌TPS-30,分别制备了这两株菌主要外膜蛋白免疫刺激复合物(MOMP-ISCOMs)。应用这两种MOMP-ISCOMs分别免疫欧洲鳗鲡,每尾腹腔注射20ug MOMP-ISCOMs,免疫40天后,用3×10~8cfu和3×10~7cfu两个剂量的TPS-30分别腹腔注射攻毒,实验结果表明,免疫鱼能抵抗3×10~7cfu剂量TPS-30菌的攻击,TPS-30 MOMP-ISCOMs免疫鱼的相对免疫保护力为80%,而L316 MOMP-ISCOMs免疫鱼的相对免疫保护力达100%,Western-blot证实免疫过的鱼血清中含有针对嗜水气单胞菌外膜蛋白抗体,实验结果初步证实嗜水气单胞菌主要外膜蛋白免疫刺激复合物能够诱导宿主产生特异性的免疫保护作用。 根据已发表嗜水气单胞菌的外膜蛋白基因Omp的核苷酸序列设计引物,利用PCR技术,扩增、克隆了嗜水气单胞菌L316的主要外膜蛋白基因(Momp),经T/A克隆,插入到pGEM-T系列载体上,测序分析结果表明Momp基因最长的开放阅读框(ORF)为1035nt,编码由344个氨基酸组成,分子量为36kDa的主要外膜蛋白质(MOMP)。应用Antheprot 5.0、ClustalW等分子生物学软件分析,显示主要外膜蛋白前24个氨基酸是较强的疏水性区域,可组成信号肽,其与Omp基因的同源率达96%,氨基酸的同源率高达98%。将此基因重组到表达质粒载体pGEX-4T-1上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,可得到高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示诱导表达的基因产物分子量约为62kDa,与预测的GST-外膜蛋白重组融合蛋白的分子量极为相似,Western-blot进一步证实,表达产物能被嗜水气单胞菌L316主要外膜蛋白特异性抗血清所识别,产生明显的染色条带,说明所表达的基因产物与天然的外膜蛋白抗原性一致。 鳗源嗜水气单胞菌L316主要外膜蛋白免疫刺激复合物的制备与应用研究,对研制鱼类疫苗学问题进行了新的初步探索;成功地克隆和表达嗜水气单胞菌L316主要外膜蛋白基因为在单因子水平上研究嗜水气单胞菌外膜蛋白的作用和免疫功能以及制备嗜水气单胞菌基因工程疫苗和亚单位疫苗奠定技术基础。
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