β-甘露聚糖酶属于半纤维素酶类,可随机水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的葡甘露聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖等多糖以释放出这些糖类中的甘露糖或功能性低聚糖。β-甘露聚糖酶来源丰富,多存在于动植物和微生物中,对于饲料、造纸、制药、石油、纺织、洗涤等行业有重要的应用价值,应用前景广阔。1.发酵条件优化:本研究采用单因素试验和响应面试验设计确定Bacillus subtilis J发酵产甘露聚糖酶的最优发酵条件。研究表明:最优的发酵条件是魔芋粉28 g/L,胰蛋白胨21 g/L,K2HPO46 g/L,Mg SO4·7H2O 1 g/L,温度31℃,p H8.5,接种量1%,装液量50 m L/250 m L,发酵周期24 h。利用优化后的条件生产β-甘露聚糖酶,其酶活力达到84.38 U/m L,是初始发酵条件产酶活力的3.36倍。通过对发酵条件的优化,大幅度提高了β-甘露聚糖酶的产量,为其工业生产提供了数据参考。2.基因组测序及基因克隆表达:通过对Bacillus subtilis J全基因组进行测序发现:该菌株基因组大小为4154006 bp,GC含量为43.41%,共编码4334个基因,根据菌种J的功能基因注释信息,从其基因组中找到一个β-甘露聚糖酶基因,其大小为1095 bp,编码364个氨基酸,预测的其分子量为41.06 k Da,理论p I为5.88,且含有一个由28个氨基酸组成的信号肽。用Pfam数据库预测其蛋白属于GH26家族。根据该β-甘露聚糖酶基因信息,设计特异性引物,对其部分序列（960 bp）进行PCR扩增后,将产物先后与p MD19-T和p ET-28a（+）连接,最后将重组的表达载体p ET-28a-man转化到E.coli BL21（DE3）中,利用IPTG对其进行低温诱导,经SDS-PAGE检测发现β-甘露聚糖酶基因以包涵体的形式在大肠杆菌细胞内成功得到表达。3.酶学性质研究及酶解产物鉴定:通过对包涵体进行尿素变性、镍柱亲和层析及透析复性,得到纯度较高的重组β-甘露聚糖酶,其分子量大小约为36k Da。酶学性质研究表明:β-甘露聚糖酶（Man）的最适反应温度和p H值为50℃和6.0;在温度低于55℃和p H为6.0-8.0时,该酶比较稳定;金属离子Ni+和Co2+对该酶有激活作用,Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cr3+和Ca2+对该酶有抑制作用,其中Mn2+的抑制作用最强,可使相对酶活降低至65.80%;化学试剂吐温20、吐温80和Triton100对β-甘露聚糖酶都用较高的激活作用,其相对酶活最高可以达到160%左右,而异丙醇、EDTA、SDS、PMSF和甲醇对β-甘露聚糖酶较强的抑制作用,其中SDS对β-甘露聚糖酶的抑制作用最强,其相对酶活几乎为0;以刺槐豆胶为底物时,酶的Vmax和Km分别为208.33μmol/（min·m L）和7.54mg/m L;利用薄层层析和质谱分析表明:该酶水解刺槐豆胶和魔芋粉时均会产生微量的单糖和由两个糖到九个糖组成的寡糖,但刺槐豆胶酶解产物以二糖到五糖为主,而魔芋粉的酶解产物组分主要以二糖到七糖为主。本研究实现了β-甘露聚酶基因的异源表达,为利用该酶催化生产甘露低聚糖的工业提供了理论研究。