Gordona terrae C-6中苯并噻吩脱硫基因的克隆及功能鉴定

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油品燃烧时,其中的硫化物转变成硫氧化物,形成酸雨污染环境。柴油中含有各种有机硫化物,其中有些用传统的物理化学脱硫方法很难去除,如二苯并噻吩(DBT)、苯并噻吩(BT)及其衍生物。对生物脱硫(BDS)的研究主要以DBT为模式化合物。相对来说,对BT的降解机理及基因的研究较少。   将DBT脱硫菌株Rhodocossus erythropolis DS-3的dszA、dszB、dszC和dszABC基因分别转入BT脱硫菌株Gordona terrae C-6中,构建了工程菌株G.terrae DRA、G.terrae DRB、G.terrae DRC和G.terrae DRABC。其中G.terrae DRA和G.terraeDRB在以DBT为唯一硫源的培养基中几乎不生长,无法降解DBT;而G.terraeDRC同表达完整DBT脱硫酶的G.terrae DRABC一样,在以DBT为唯一硫源的培养基中生长良好,亦能降解大部分DBT(84%)。这表明催化BT和DBT前两步脱硫反应的BT单加氧酶和DBT单加氧酶是负责底物识别的关键酶,催化BT和DBT后两步脱硫反应的酶功能相似。Rhodocossus erythropolis DS-3中的DBT脱硫基因与Gordona terrae C-6中的BT脱硫基因具有较高的同源性。   应用兼并PCR技术等方法从戈登氏菌Gordona terrae C-6中克隆了BT脱硫酶基因bdsA、bdsB和bdsC。其中,bdsA与dszA的同源性为99%(1363/1366);bdsB与dszB的同源性为99%(1092/1098);bdsC与dszC的同源性为98%(1239/1254)。BdsA、BdsB和BdsC的模拟三维结构分析表明,BdsA与DszA、BdsB与DszB的三维结构基本一致,其功能可能相似。BdsC与DszC的三维结构有一定的差别,它可能是整个途径中用于识别底物的关键酶。   将bdsABC分别转入大肠杆菌中进行表达,BdsA、BdsB和BdsC分子量分别为48kD、38kD和45kD与氨基酸分析结果一致。在大肠杆菌中共表达dszX和bds(ABC-x)(X=A、或B、或C、或AB、或BC、或AC、或ABC)以检测相应酶在功能上的互补性。结果同样证明了BdsA与DszA、BdsB与DszB的功能可能相似。BdsC与DszC可能是整个途径中用于识别底物的关键酶。   利用红球菌-大肠杆菌穿梭载体pRHK1将BT降解菌Gordona terrae C-6的脱硫基因bdsA、bdsB、bdsC和bdsABC分别转入DBT降解菌R.erythropolis DS-3中,构建了工程菌株R.erythropolis CRA、R.erythropolis CRB、R.erythropolis CRC和R.erythropolis CRABC。其中,R.erythropolis CRC和R.erythropolis CRABC能以BT为硫源生长,其他菌株无法利用BT。在抗生素的选择压力下,传代10次后重组质粒pRCC仍能在R.erythropolis DS-3中稳定存在;而在Gordina terrae C-6中传代6次后就逐渐丢失。可见,R.erythropolis CRC的稳定性高于G.terrae DRC,对于以后的应用有更大的潜力。
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