【摘 要】
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目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）起源于间叶组织,是常见的恶性骨肿瘤之一,好发于青少年。它有复发率高、侵袭性强、早期易转移,尤其是肺转移等特点。骨肉瘤的早期诊断相对较难,治愈率也很低。目前,骨肉瘤的主要治疗方法是新辅助化疗和手术切除相结合,但效果仍不理想。随着分子生物学的发展和对肿瘤分子遗传学的深入研究,基因靶向治疗等非手术治疗为骨肉瘤的治疗提供了新的途径。URG4是一种上调细胞增殖基
【基金项目】
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项目名称:核糖体蛋白L34通过MYC/RPL34/EIF3A信号轴调控人骨肉瘤细胞增殖的机制研究,项目合同编号:81760485,项目来源:国家自然科学基金项目起止时间:2018.01.01—2021.12.31
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目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）起源于间叶组织,是常见的恶性骨肿瘤之一,好发于青少年。它有复发率高、侵袭性强、早期易转移,尤其是肺转移等特点。骨肉瘤的早期诊断相对较难,治愈率也很低。目前,骨肉瘤的主要治疗方法是新辅助化疗和手术切除相结合,但效果仍不理想。随着分子生物学的发展和对肿瘤分子遗传学的深入研究,基因靶向治疗等非手术治疗为骨肉瘤的治疗提供了新的途径。URG4是一种上调细胞增殖基因,近期发现它在肿瘤发生、发展、侵袭和转移等有重要的作用。本研究目的是探讨URG4在骨肉瘤中的表达和临床意义,以及它对骨肉瘤增殖、迁徙、侵袭和成瘤能力等功能的影响及相关机制。方法:1.收集骨肉瘤标本和相关病人的临床资料,应用免疫组织化学技术检测URG4在40例骨肉瘤及其相应瘤旁组织中的蛋白表达,然后分析URG4的表达情况与骨肉瘤临床病理数据的关系。2.QPCR和Western-blot检测URG4基因在人骨肉瘤细胞株MG63,HOS,143B,U2OS,Saos-2和人成骨细胞h FOB1.19中m RNA水平及蛋白表达情况;建立稳转敲低URG4（si URG4-1、si URG4-2）和空载体（NC）的骨肉瘤细胞系（MG63,HOS）模型,应用CCK8、平板克隆、流式细胞仪、划痕、Transwell和裸鼠皮下成瘤实验进行细胞增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭和成瘤能力等功能实验,以明确URG4基因对骨肉瘤细胞生物学功能的影响。3.首先,通过MEM数据库和TARGET数据库筛选与URG4共表达的基因;使用DAVID6.8在线数据库对URG4共表达基因进行GO分析,探寻共表达基因可能的效应;使用KEGG分析共表达基因在不同信号通路中的富集情况,探寻URG4可能参与的信号通路;使用STRING数据库分析与URG4互作的蛋白。然后,应用核染色观察URG4敲低后经典Wnt通路关键蛋白β-catenin在骨肉瘤细胞核内表达变化情况,最后通过Western-blot检测URG4敲低后经典Wnt通路的相关蛋白（GSK3β、P-GSK3β、β-catenin）和它下游靶基因（c-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9）蛋白的变化情况。结果:1.临床相关性结果显示:（1）40例骨肉瘤组织URG4表达（阴性0例,弱阳性1例,阳性17例,强阳性22例）阳性及强阳性率（97.50%）,相应的瘤旁组织中URG4蛋白表达（阴性2例,弱阳性37例,阳性1例,强阳性0例）阳性及强阳性率（2.50%）,两者比较差异有显著统计学意义（P0.05）。2.QPCR和Western Blot结果证实URG4在5种人骨肉瘤细胞株中的m RNA和蛋白表达水平较人成骨细胞高。3.敲低URG4可抑制骨肉瘤细胞的增殖:CCK8法检测,敲低URG4后2种骨肉瘤细胞增殖在3,4天后明显出现抑制,与阴性对照组（NC组）比较有显著统计学意义（P<0.001）。平板克隆实验显示,两株敲低URG4骨肉瘤细胞克隆形成能力较NC组明显下降,差异有显著统计学意义（P<0.01）。4.流式细胞技术检测表明,两URG4敲低的骨肉瘤细胞凋亡率明显高于对照组,差异有显著统计学意义（P<0.01）。敲低URG4能够使骨肉瘤细胞停留在细胞周期的G0/G1期,使进入S期的细胞数量较少,从而抑制了骨肉瘤细胞的生长周期,进而抑制了细胞生长（P<0.05）。5.伤痕愈合实验证明,URG4被敲低组细胞划痕处的细胞迀移修复面积明显少于NC组,比较均差异有统计学意义（P<0.01）。6.Transwell迁徙实验表明,敲低URG4后能降低两种骨肉瘤细胞的迁徙能力,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。7.裸鼠成瘤实验证明,URG4敲低组肿瘤生长更为缓慢、瘤体体积明显减小、瘤体重量明显减轻,与对照组比较差异有统计学意义（P0.05）,GSK3βser9磷酸化蛋白及细胞核内β-catenin蛋白的表达量明显减少（P<0.001）。敲低URG4的骨肉瘤细胞内的Cyclin D1、c-Myc、MMP-2、MMP-9表达水平均明显低于对照组细胞。结论:1.URG4在骨肉瘤组织中呈高表达,而在瘤旁组织中不表达或低表达。URG4在骨肉瘤中的表达与肿瘤大小、肿瘤的转移及Enneking分期程度呈正相关,但与性别、年龄、位置、肿瘤坏死率、组织类型无明显相关性。2.URG4在人骨肉瘤细胞株中呈高表达,敲低URG4的表达可促进细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制骨肉瘤细胞的增殖、降低细胞迁移与侵袭及裸鼠成瘤能力。反过来这也证明,URG4可促进骨肉瘤的发展、侵袭和转移过程。3.敲低URG4使骨肉瘤细胞核内β-catenin蛋白减少,抑制经典Wnt通路的活性,从而抑制其下游靶基因Cyclin D1、c-Myc、MMP-2、MMP-9的表达。本研究结果表明URG4可能通过激活经典的Wnt信号通路来促进骨肉瘤的增殖、侵袭和转移。URG4可能是骨肉瘤的新型生物标志物和潜在治疗的靶标。
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