背景与目的：　　自顺铂等铂类抗癌药物应用于临床并取得了良好的效果以来，以金属为基础的抗癌药物引起了研究人员的广泛关注。近年来，大量研究表明铜、锌等金属配合物能通过抑制肿瘤细胞的泛素-蛋白酶体系统诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥其抗肿瘤效应。泛素蛋白酶体系统介导了真核细胞内80％以上蛋白质的降解，其降解蛋白质的过程主要由三部分组成：靶蛋白在泛素活化酶等相关酶的作用下标记上泛素链、被标记的靶蛋白被蛋白酶体识别并降解和去泛素化酶对靶蛋白上泛素链的移除。已经被美国 FDA批准用于临床治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤等疾病的硼替佐米是作用于蛋白酶体降解蛋白的核心颗粒。蛋白酶体抑制剂硼替佐米在临床上的成功促使蛋白酶体系统作为一种新型的分子靶标得到广泛的研究。因此，针对该系统其他组分的药物开发同样具有广阔的临床前景。越来越多的研究表明，去泛素化酶作为蛋白酶体发挥功能的关键环节参与并调节了细胞周期、凋亡和转录等生命过程，与肿瘤的发生发展密切相关。与蛋白酶体抑制剂不同，大部分去泛素化酶抑制剂可以特异性地抑制一种或几种去泛素化酶，从而选择性调控相关蛋白的变化，因此去泛素化酶抑制剂更具选择性。根据我们课题组前期的研究，铜离子金属配合物展现出了良好的去泛素化酶抑制作用。因此，在顺铂等金属抗癌药物在临床上的应用逐渐受到限制的同时，新型金属配合物作为去泛素化酶抑制剂被发现，对抗肿瘤药物的研究具有重要意义。　　本论文以具有良好生物活性的2-巯基吡啶氮氧化物作为配体，合成了多种潜在的具有抗癌活性的过渡金属配合物。探讨了铂、镍两种金属配合物作为蛋白酶体去泛素化酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用。　　方法与结果：　　1.1-氧化吡啶巯基铂（Platinum Pyrithione，PtPT）靶点分析及其抗肿瘤效用。运用可见紫外光谱法和荧光光谱发分析了1-氧化吡啶巯基铂即PtPT与DNA分子间直接结合作用。结果发现，与顺铂不同，作为铂离子配合物PtPT不能与DNA分子间发生直接相互作用。通过细胞免疫荧光方法和蛋白免疫印迹法发现PtPT未引起肿瘤细胞和非转化正常细胞内DNA损伤效应分子γ-H2AX,、p-ATM,、p-chk2、p-chk1表达的增多。同时，以A549、A549/DDP、K562和稳定转染GFPu的HEK293细胞为模型，通过免疫印迹实验发现，PtPT能引起细胞内大量泛素化蛋白的聚集，蛋白酶体内源性底物p27和蛋白酶体外源性底物GFPu的增多，但对纯化的20S以及细胞内蛋白酶体的活性亚单位的酶解活性没有影响。通过相关实验我们发现PtPT可以剂量依赖地抑制26S蛋白酶体相关去泛素化酶的活性，但对细胞内总的去泛素化酶和非26S蛋白酶体相关人重组去泛素化酶无影响。运用计算机分子对接技术发现PtPT可与USP14和UCHL5活性位点的氨基酸残基发生作用。而通过HA-UbVS竞争性结合实验进一步证实PtPT的作用靶点的确位于USP14和UCHL5。在与顺铂抗肿瘤作用的比较中我们发现，PtPT可选择性诱导肿瘤细胞死亡，表现出比顺铂更好的肿瘤细胞杀伤作用，对顺铂耐药的细胞同样有效，相同剂量下对非转化正常细胞作用较弱。实验发现PtPT诱导肿瘤细胞凋亡的途径与caspase相关蛋白的活化有关，且PtPT诱导的蛋白酶体功能抑制早于细胞凋亡的产生，同时金属离子螯合剂EDTA可以部分逆转PtPT诱导的泛素蛋白聚集和细胞死亡，表明蛋白酶体功能抑制是诱导细胞凋亡所必须。通过采集临床白血病病人的单个核细胞和健康自愿者的外周血单个核细胞作为研究对象，与顺铂和硼替佐米相比，我们发现 PtPT可以显著诱导病人单个核细胞的死亡，但对正常人外周血单个核细胞作用弱很多。同时， Western Blot结果显示PtPT可诱导白血病细胞泛素化蛋白的聚集。在A549和K562细胞裸鼠移植瘤动物模型的实验中，我们发现与顺铂相比PtPT既可显著抑制肿瘤组织的生长，同时对实验动物体重等其他机能无影响。免疫组化结果发现 PtPT可引起肿瘤组织泛素化蛋白、p21和p27的聚集以及caspase-3的活化，表明PtPT诱导的肿瘤组织细胞凋亡与蛋白酶体功能抑制有关。　　2.1.1-氧化吡啶巯基镍（Nickel Pyrithione，NiPT）靶点分析及其抗肿瘤效用。通过MTS法比较了1-氧化吡啶巯基镍即NiPT与顺铂的抗肿瘤活性。结果显示NiPT可选择性诱导肿瘤细胞死亡，展现出比顺铂更好的肿瘤细胞毒性作用，对顺铂耐药的细胞同样有效，相同剂量下对非转化的正常细胞作用较弱。相关实验发现NiPT诱导肿瘤细胞凋亡途径与caspase相关蛋白的活化有关。以A549、A549/DDP、K562和稳定转染GFPu的HEK293细胞为模型，通过免疫印迹实验发现， NiPT能引起细胞内大量泛素化蛋白的聚集，蛋白酶体内源性底物p27和蛋白酶体外源性底物GFPu的增多，但对纯化的20S以及细胞内蛋白酶体的活性亚单位的酶解活性没有影响。通过多相关实验我们发现NiPT可显著抑制26S蛋白酶体相关去泛素化酶的活性，对细胞内总的去泛素化酶也有部分抑制作用。运用计算机分子对接技术发现NiPT可与USP14和UCHL5活性位点的氨基酸残基发生作用。而通过HA-UbVS竞争性结合实验进一步证实NiPT的确作用于USP14和UCHL5。运用可见紫外光谱法和荧光光谱发分析了NiPT与DNA分子间的相互作用情况，结果发现作为金属配合物NiPT不能与DNA分子间发生直接相互作用。通过细胞免疫荧光方法和蛋白免疫印迹法发现NiPT未引起肿瘤细胞DNA损伤效应分子γ-H2AX,、p-ATM,、p-chk2和p-chk1表达的增多。NiPT诱导的泛素化蛋白聚集和细胞死亡能被EDTA完全逆转，表明NiPT中金属离子是其发挥功能的活性基团。通过采集临床白血病病人的单个核细胞和健康自愿者的外周血单个核细胞作为研究对象，与顺铂和硼替佐米相比，我们发现NiPT可以显著诱导病人单个核细胞的死亡，但对正常人外周血单个核细胞作用较弱。同时， Western Blot结果显示NiPT可诱导白血病细胞泛素化蛋白的聚集。通过A549和K562细胞裸鼠移植瘤动物模型，我们发现NiPT可显著抑制肿瘤组织的生长。免疫组化结果发现PtPT可引起肿瘤组织泛素化蛋白、p21和p27的聚集并伴有caspase-3切割蛋白的出现，表明NiPT诱导的肿瘤组织细胞的凋亡与蛋白酶体功能抑制有关。　　结论：　　1. PtPT通过选择性抑制26S蛋白酶体相关去泛素化酶UCHL5和USP14活性从而选择性抑制肿瘤细胞生长。　　2. NiPT通过抑制26S蛋白酶体相关去泛素化酶发挥其抗肿瘤效应。