目的:在缺血性卒中的发病机制中,缺血脑组织内的局部炎症以及全身免疫抑制作用起着关键的作用,但是对于缺血后处理(Ischemia postconditioning,IPostC)是如何影响缺血脑组织的局部炎症及中枢和外周免疫细胞的研究较少,相关机制还不十分明确。在本研究中,我们利用C57/BL6小鼠建立了IPostC模型,探索IPostC的神经保护作用。通过使用质谱流式细胞技术(CyTOF),量化了缺血再灌注损伤后的免疫细胞表型,研究细胞表面标记物的表达水平的变化,明确外周血和脑组织中免疫细胞相关的信号通路与缺血性卒中引起的神经炎症之间的关系。进一步阐述缺血后处理是如何影响缺血脑组织免疫细胞的浸润,以及与卒中诱导的免疫抑制相关的淋巴细胞减少症。在脑缺血再灌注损伤中,氧化应激起着重要的作用。富马酸二甲酯及其代谢产物富马酸单甲酯是抗氧化剂,可以通过激活核因子红细胞-2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)途径从而诱导下游抗氧化蛋白的表达。在本研究中,我们进一步阐述了DMF在缺血性卒中急性和亚急性期对再灌注损伤的作用,以及这种作用是否与Nrf2途径的激活相关。鉴于DMF与MMF有着显着的生物学差异,我们对DMF和MMF进行了比较。方法:我们利用CD57/BL6小鼠建立MCAO模型,随机分为Sham,MCAO和IPostC组。后处理方式为再灌注后2分钟开始,对大脑中动脉进行3次15秒闭塞/30秒释放的处理。再灌注后的第1天和第3天,采用TTC染色法测量脑梗死体积,并对小鼠进行神经功能学评分(mNSS,Corner test,vibrissae-elicited forelimb placing test),提取缺血脑组织和外周血中的单个核细胞,同时使用38种抗体进行染色,包括细胞表面标记,以及细胞信号传导途径中对免疫细胞活性起关键作用的磷酸化蛋白。采用CyTOF技术对样本进行检测,并通过viSNE,SPADE(spanning-tree progression analysis of density-normalized events)以及热图分析方法处理质谱流式细胞数据。利用小鼠短暂局灶性脑缺血模型,研究DMF及其代谢产物MMF在急性缺血性卒中的保护作用。在缺血再灌注后第3天,通过TTC染色评价梗死体积,测定脑水肿,进行神经功能缺损评分,并用核磁纵向分析梗死体积的变化情况。应用组织学染色方法对神经细胞的凋亡和神经胶质细胞的激活进行评价。RT-PCR和Western blot用于检测与Nrf2途径有关的基因和蛋白的表达。对于机制方面的研究,我们利用Nrf2基因敲除小鼠建立MCAO模型,测量梗死体积,神经功能评分和脑水肿,进一步评价DMF及其代谢产物MMF对缺血性卒中的神经保护作用是否依赖于Nrf2途径的调节。结果:我们的研究结果表明,IPostC显著减小了缺血再灌注损伤后的梗死体积,降低了小鼠的神经功能缺损评分。IPostC在小鼠中的保护作用可能是由于改善了颅内侧支循环的血液供应。缺血脑组织中白细胞总数在第1天增加,第3天达到峰值。巨噬细胞来源的小胶质细胞(Microglia derived macrophage,MiDMs),巨噬细胞来源的单核细胞(Monocyte derived macrophage,MoDMs),嗜中性粒细胞(Neutrophil),γδ细胞,CD4~+T细胞,CD8~+T细胞,Eff/mem CD4~+T细胞,Eff/mem CD8~+T细胞,NK细胞,NKT细胞,cDCs细胞的数量在卒中发作后升高,3天达到峰值。而在缺血后处理组,与Sham和MCAO组相比,浸润的免疫细胞数量均有下降。在缺血性卒中后第1天和第3天,外周血中白细胞计数减少。Monocyte,Neutrophil,γδT细胞,CD4~+T细胞,CD8~+T细胞,Eff/mem CD4~+T细胞,Eff/mem CD8~+T细胞,NK细胞,NKT细胞,cDCs细胞的数量下降。在缺血后处理组,与Sham和MCAO组相比,这几种类型的细胞数量增加。以上结果证实,IPostC抑制了缺血性脑损伤导致的脑部炎症并减弱周围淋巴细胞减少症。我们通过SPADE分析鉴定了细胞表型,包括CD45,CD49b,CD11c,Ly6G,Ly6C,B220,CD3,CD4,CD8,CD44和CD25等。并进一步分析总结了在卒中后细胞群发生显著改变的蛋白。结果显示,MiDMs和MoDMs中的CD45和CD11b的表达,Neutrophil中的Ly6C的表达,B细胞中的B220的表达,CD4~+T细胞中CD4的表达,CD8~+T细胞中CD8的表达,CD44在Eff/mem CD4~+T和CD8~+T中的表达,NK细胞中CD49b的表达,Treg细胞中CD25的表达,在卒中后第1天和第3天都显著上调,在缺血后处理后下降。在缺血脑组织和外周血的单核细胞及嗜中性粒细胞中,测得IkBa,pAKT,pP38和pEGFR的表达水平稳步增加,缺血后处理后表达水平下降。在缺血性卒中的亚急性期,DMF及其代谢产物MMF的神经保护作用最明显。结果显示DMF和MMF能够显著减轻卒中后神经功能缺损症状,减小脑梗死体积,减轻脑水肿。此外,DMF和MMF可以抑制脑缺血后的神经细胞凋亡和胶质细胞激活。而在Nrf2基因敲除小鼠诱导的MCAO模型中,DMF和MMF没有这种保护作用,表明Nrf2途径是DMF和MMF发挥保护作用所必需的。结论:我们的研究结果表明,IPostC可以减少脑缺血再灌注损伤引起的固有和适应性免疫细胞向CNS的浸润,从而起到神经保护作用。此外,IPostC有力减弱了周围淋巴细胞减少症,从而改善了卒中后全身性免疫抑制。而细胞表面标记或细胞信号通路关键蛋白的上调与中的卒中导致的神经炎症密切相关。DMF及其代谢产物MMF在急性和亚急性脑缺血再灌注损伤中具有神经保护作用,其保护作用可能由Nrf2途径介导。这进一步为DMF和MMF治疗脑缺血再灌注损伤提供了可能的理论依据,本研究也为缺血性卒中的治疗提供了新的靶点。