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犬肾细胞(Madin Darby Canine Kidney,MDCK)作为流感病毒类疫苗生产最常用的细胞系之一。前人研究发现,贴壁MDCK细胞作为连续细胞系在长期传代过程中会出现细胞形态、生长能力改变,流感病毒生产能力下降等不稳定问题。但更具应用价值的无血清悬浮MDCK细胞经长期传代后,其生产流感病毒过程的稳定性特征尚不明确。因此,有必要对长期传代培养过程中的悬浮MDCK细胞形态、生长能力以及生产流感病毒过程的稳定性进行研究。本文以悬浮MDCK细胞生产H9N2禽流感病毒过程为研究对象。首先,对实验室已有的悬浮MDCK细胞进行长达200天以上传代培养,获得P1、P29、P63、P88、P111多个代次悬浮MDCK细胞。在考察各代次细胞形态以及生长稳定性中,发现各代次细胞形态相似且良好,无明显结团现象;在传代培养以及批培养过程中5个代次细胞比生长速率、细胞直径、细胞活率之间无显著性差异,生长能力维持稳定。在病毒生产稳定性的考察中,以P1、P29、P88、P111共4个代次悬浮MDCK细胞为研究对象,实验结果表明,血凝效价(HA滴度)与单细胞产毒率(Svy)均随着细胞代次的增加而增加,其中P111细胞最高HA滴度高于P1细胞0.47 Log2HAU/100 μ1。为进一步研究悬浮MDCK细胞流感病毒生产不稳定的特性是否会受到病毒生产过程操作条件的影响,以最低代次细胞(P1)与最高代次细胞(P111)为研究对象,考察营养物、MOI、pH、乳酸等病毒生产操作条件对P1、P111产毒差异的影响。结果表明在各实验条件下,P111的HAmax与Svymax均高于P1细胞,HAmax差距为0.15-1.09 Log2HAU/100 μl,Svymax差距为3505.28-15779.11 virions/cell。实验结果表明高代次悬浮MDCK细胞病毒高产的特性并不受生产过程操作条件的影响。以P1、P111细胞为研究对象,实验探究高低代次悬浮MDCK细胞生产流感病毒过程的特征。结果表明,流感病毒生产早期,P111单个细胞的流感病毒颗粒释放速率高于P1细胞,其中在6-7 hpi时,该差距最大为1611.88 virions/cell/h。另外发现,P111细胞处于G0/G1期的细胞比例比P1细胞高约10%;P111胞内ROS水平却低于P1细胞,0 hpi、6 hpi分别为P1胞内ROS水平的47.00%、83.11%。借助转录组手段,对高低代次细胞基因表达水平进行分析,发现差异基因主要富集在MAPK、PI3K-Akt、胞吞作用、ABC转运蛋白信号通路。并且促进G0/G1期阻滞以及ROS清除相关蛋白基因出现显著变化。通过本文研究,确定了悬浮MDCK细胞在长期传代过程中细胞生长以及流感病毒生产的稳定性,并初步探究了高低代次细胞产毒差异的原因。研究结果将为悬浮MDCK细胞生产流感病毒工艺的开发提供重要的技术支持。