柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama是一种严重危害柑橘产业的重要害虫,可通过取食韧皮部汁液、分泌蜜露诱发煤烟病等方式直接对柑橘果树造成危害,但其最大的危害是传播世界性柑橘毁灭病害——柑橘黄龙病。柑橘黄龙病已给多个国家的柑橘产业带来了巨大的经济损失,其中美国、巴西、中国的危害最为严重。由于目前仍没有直接用于防治柑橘黄龙病的有效方法,因此“三板斧”（选用无病苗木、防控柑橘木虱、及时挖除病株）仍是主要防控策略。通过减少柑橘木虱种群数量可有效减缓柑橘黄龙病的传播蔓延。柑橘木虱的防治方法包括化学、生物、物理防治等,其中应用最为广泛是化学防治方法。然而,由于杀虫剂的长期大量使用,已经导致多地柑橘木虱对多种药剂产生了一定程度的抗药性。因此,开展柑橘木虱对药剂敏感性的研究对于防控柑橘木虱意义重大。昆虫的三大解毒酶系（羧酸酯酶系、谷胱甘肽S-转移酶系和细胞色素P450酶系）与抗药性产生密切相关。其中,细胞色素P450还原酶作为细胞色素P450酶系的主要成员,可为细胞色素P450参与的杀虫剂解毒代谢过程提供电子,从而参与介导昆虫对杀虫剂的敏感性。为探究细胞色素P450还原酶在柑橘木虱对新烟碱类杀虫剂敏感性中的作用,本研究鉴定并克隆了柑橘木虱细胞色素P450还原酶基因DcCPR,并进行生物信息学和系统发育分析;通过RT-qPCR技术解析了DcCPR在柑橘木虱不同发育阶段和组织的表达模式;利用RNAi和真核表达技术探究了DcCPR在柑橘木虱对吡虫啉和噻虫嗪敏感性中的作用。研究结果为柑橘木虱抗药性机制的研究提供了一定的理论支撑。主要研究结果如下:1柑橘木虱DcCPR克隆及生物信息学分析根据褐飞虱Nilaparvata lugens、灰飞虱Laodelphax striatellus和烟粉虱Bemisia tabaci细胞色素P450还原酶基因（CPR）序列,通过NCBI比对获得柑橘木虱DcCPR基因序列。克隆获得DcCPR基因ORF全长为2058个核苷酸,编码685个氨基酸,DcCPR蛋白p I为5.37,Mw为77.5 k Da。将DcCPR蛋白与其他29个物种CPR蛋白进行序列比对,发现其含有CPR蛋白特有的三大保守结构域（NADP结合域、FAD结合域、FMN结合域）、FAD结合域核心位点（R462,Y464,S465）和催化残基（S465,C637,D682,W684）;且DcCPR蛋白与其他半翅目昆虫CPR蛋白具有序列高度相似性,如与白背飞虱Sogatella furcifera、灰飞虱、褐飞虱、烟粉虱的CPR相似度分别为70.9%、70.5%、68.8%、68.4%。系统发育分析表明,柑橘木虱DcCPR与上述4种半翅目昆虫的CPR归在同一分支,5者有较近的进化关系。2柑橘木虱DcCPR时空表达模式分析利用RT-qPCR技术分析DcCPR在柑橘木虱不同发育阶段（1龄若虫、5龄若虫、羽化1天成虫、羽化15天成虫）和不同组织（头、翅、足、表皮、马氏管、中肠、脂肪体）的表达模式。结果表明:对于不同发育阶段,DcCPR在1龄若虫中表达量最高,在羽化15天成虫中表达量最低;对于不同组织,DcCPR在中肠表达量最高。3柑橘木虱DcCPR功能研究利用RNAi技术,采用优化后薄膜饲喂法对柑橘木虱成虫连续饲喂ds CPR 72h。检测到DcCPR基因沉默效率为68.4%,DcCPR蛋白活性下降41.6%;Western-blot结果表明DcCPR蛋白含量下降37%,与酶活性测定结果相一致。同时,也检测到P450酶活性下降44.7%。通过浸叶法进行生物测定发现,在有效沉默DcCPR基因表达后,柑橘木虱对吡虫啉（20.435 mg/L）和噻虫嗪（5.334 mg/L）的敏感性均显著提升,死亡率分别增加27.9%和37.9%。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在Sf9细胞成功表达出具有催化活性的DcCPR重组蛋白。且细胞毒性测定发现,含DcCPR重组蛋白的Sf9细胞在吡虫啉或噻虫嗪处理下存活率均显著增加。综上所述,DcCPR在柑橘木虱对吡虫啉和噻虫嗪敏感性中发挥重要作用。