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研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)居高不下的患病率及其多种相关并发症,严重威胁人类的身心健康。糖尿病性心肌损伤(diabetic myocardialinjury,DMI)作为DM的主要心血管并发症之一,指即使不伴有冠状动脉硬化或高血压等其它心血管疾病,心脏在持续高糖的环境下仍可出现一系列心肌结构损伤及功能异常,并最终引发心力衰竭、心律失常、猝死,致残和致死率极高。DMI致病过程中的相关分子机制极为复杂,信号通路众多,尚未被详尽阐明。氧连-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰是一种蛋白质翻译后修饰,广泛参与调控细胞内多种病理生理过程。同时,自噬作为细胞内一种程序性死亡,由自噬体的形成、膜的延伸以及自噬溶酶体降解等多个环节组成,其整个过程又被称之为自噬流,对维持细胞自身稳态具有重要意义。虽然O-GlcNAc修饰与自噬均分别被证实与DMI的发生有密切关系,但对于两者在DMI中的关联机制知之甚少。新近研究显示,在果蝇、线虫等多种生物模型中,膜突触相关蛋白SNAP 29可与STX17,VAMP8形成复合物影响自噬流的过程,同时SNAP29可作为底物蛋白被O-GlcNAc修饰。我们前期研究发现,链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的DMI大鼠模型中O-GlcNAc糖基化水平升高,并伴有自噬流的抑制。然而,在哺乳动物DM疾病模型中,O-GlcNAc修饰SNAP29是否参与调控自噬流以及其具体分子机制的研究未见报道。研究目的:既往研究提示,蛋白SNAP29既可参与自噬过程,也可被O-GlcNAc修饰,是解析O-GlcNAc修饰与自噬关联机制的纽带。O-GlcNAc修饰、自噬及DMI三者之间的相互关联启发我们研究探索:O-GlcNAc修饰SNAP29是否通过调控自噬流参与DMI的致病过程?为此,我们通过在体动物和离体细胞实验揭示O-GlcNAc糖基化修饰SNAP29通过调控自噬流参与DMI的发生及发展,并探讨其潜在的分子机制以及作用的具体环节,为将来DMI的临床治疗提供了可能的新靶点与机遇。研究方法:在体动物实验将大鼠分为四组:对照组(Vehicle)、糖尿病+生理盐水组(STZ+Nacl)、糖尿病+O-GlcNAc糖基化抑制剂组(STZ+6-Diazo-5-oxo-L-norleucine,STZ+Don)以及糖尿病+O-GlcNAc糖基化激动剂组(STZ+Thiamet G,STZ+TG)。本研究动物实验所采用实验方法包括:血糖和体重测定、超声心动图(Vevo2100)、Western-Blot、免疫共沉淀、组织学苏木-伊红(Hemotoxylin&Eosin,HE)染色、马松(Masson)染色、透射电子显微镜等。细胞实验所采用实验方法包括:原代乳鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs)分离和培养、高糖(Glu:25 mM/L)处理、Western-Blot、免疫共沉淀、腺病毒载体构建和质粒的分离纯化及透射电子显微镜等。离体细胞实验分为:正常糖浓度处理组(normal glucose,Vehicle)、高糖浓度处理组(high glucose,Glu)、正常糖+O-GlcNAc糖基化激动剂组(TG)、高糖+O-GlcNAc糖基化激动剂组(Glu+TG)、正常糖+O-GlcNAc糖基化抑制剂组(Don)和高糖+O-GlcNAc糖基化抑制剂组(Glu+Don),以及基因转染技术干预后的正常糖转染对照组(con+sh-ctrl组)、正常糖转染干扰OGT组(con+sh-OGT)、正常糖转染过表达OGA组(con+ad-OGA)、高糖转染对照组(Glu+sh-ctrl)、高糖转染干扰OGT组(Glu+sh-OGT)、高糖转染过表达OGA组(Glu+ad-OGA)。研究结果:1.经STZ诱导8周的大鼠(8-week STZ大鼠)呈现典型的Ⅰ型DM表现,伴有DMI,心肌O-GlcNAc修饰的增加与自噬流的抑制。结果显示:8-week STZ组大鼠相比正常对照组(Vehicle组),血糖增高、饮食饮水量增加,体重下降,心脏肥厚(心脏重量/体重比值增加);超声结果显示:心脏舒张功能减退(E/A比值明显下降)及左室质量、左室舒张/收缩末容积的明显增加;组织学检测结果显示:心肌排列紊乱、脂肪堆积、纤维增生。8-week STZ大鼠血糖持续升高的同时,利用Western-Blot检测到O-GlcNAc修饰水平及其N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)表达增加,N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)的表达降低;同时检测自噬相关标记蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ与P62的表达增加,透射电子显微镜下可观察到明显蓄积的自噬体。2.在体增加O-GlcNAc修饰可加重Ⅰ型DM大鼠心肌损伤并抑制其自噬流。分别给予STZ大鼠O-GlcNAc糖基化修饰激动剂(Thiamet-G,TG)与抑制剂(6-diazo-5-oxo-l-norleucine,Don),结果显示:TG导致STZ大鼠心肌O-GlcNAc修饰增加,心脏舒张功能恶化(E/A下降或E/A大于2),左室舒张/收缩末容积的明显增加,心肌排列紊乱、脂肪堆积、纤维增生加重,且自噬流被进一步抑制;而Don可降低O-GlcNAc修饰水平,同时缓解恶化的心脏舒张功能、减少左室舒张/收缩末容积,以及改善心肌异常结构,并使得自噬流顺利进行。3.离体增加O-GlcNAc修饰可抑制NRCMs自噬流进行。与在体实验一致,离体NRCMs经高糖刺激后,分别给予TG与Don,结果显示:TG增加NRCMs O-GlcNAc修饰的同时,LC3Ⅱ/Ⅰ,Beclin1,P62,LAMP2表达水平均增高,自噬流进一步被阻碍;相反,Don则明显降低O-GlcNAc水平,可促进自噬流进行。利用基因转染技术,同样证实干扰OGT或过表达OGA均可降低O-GlcNAc修饰,促进自噬流进行。4.高糖抑制自噬流的降解阶段。在NRCMs水平,通过干扰LAMP2的表达、给予自噬抑制剂3-MA,分别抑制自噬流的降解及起始阶段;高糖水平下,干扰LAMP2不能进一步增加Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平;经自噬起始抑制剂3-MA干预,LC3Ⅱ/Ⅰ与P62的表达水平,不同于单纯高糖诱导的NRCMs,而出现下降;以上均证实高糖并不影响自噬的起始阶段,而是参与抑制自噬的降解阶段。5.SNAP29 O-GlcNAc修饰阻碍SNAP29-STX17-VAMP8复合物形成而抑制自噬流的降解阶段。采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测到SNAP29的O-GlcNAc修饰可通过负向调控SANP29-VAMP8-STX17复合物的形成影响自噬流的降解。激动剂TG增加SNAP29的O-GlcNAc修饰,同时减少SNAP29、VAMP8、STX17三者间相互结合;给予抑制剂Don、沉默OGT或过表达OGA可减少SNAP29 O-GlcNAc修饰,而促进SNAP29-VAMP8-STX17三者复合物形成。结论:1.8-week的STZ大鼠具有典型的早期Ⅰ型DMI表现:心脏舒张功能减退,左室质量、左室舒张/收缩末容积的明显增加及心肌排列紊乱,脂肪堆积,纤维增生;2.8-week的STZ大鼠中心肌O-GlcNAc修饰增加,自噬流受抑制,DMI加重;3.在体动物与离体细胞实验一致证实,增加O-GlcNAc修饰水平,自噬流将进一步被抑制;而减少O-GlcNAc修饰,使自噬流恢复顺畅;4.高糖影响自噬的具体环节是抑制自噬流的降解阶段5.首次证实,Ⅰ型DMI中O-GlcNAc修饰抑制自噬流降解阶段的具体分子机制是:O-GlcNAc修饰通过阻碍复合物SNAP29-STX17-VAMP8的形成,从而抑制由该复合物介导的自噬流降解的过程。