研究背景:淋巴结转移（lymph node metastasis,LNM）是胃癌（gastric cancer,GC）转移的主要途径,是肿瘤进展和预后不良的重要标志。肿瘤淋巴管浸润（Lymphatic invasion,LI）是LNM的前驱步骤。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）在肿瘤发生、进展及影响治疗反应和预后等方面发挥重要作用。TME中浸润的中性粒细胞称为肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils,TANs）,在肿瘤发生发展中具有多方面的功能。我们前期研究提示,TANs与胃癌LNM显著相关,但其机制不详。中医学从患者整体出发,辨证施治,将扶正与祛邪相结合,肿瘤微环境也逐渐成为中医药抗肿瘤的重要靶点。研究肿瘤临床病理特征与胃癌中医辨证分型的相关性,以及TANs促进胃癌LNM的分子机制,有望为胃癌进展机制研究及临床治疗提供新的思路。第一部分:早期胃癌临床病理特征与中医辨证分型的相关性研究目的:探讨早期胃癌（early gastric cancer,EGC）患者的术前胃癌中医辨证分型与临床病理特征（包括TANs）的相关性。方法:收集南京中医药大学附属医院（江苏省中医院）2011年1月至2020年12月连续入组的T1b期胃癌（肿瘤浸润粘膜下层）病例,收集术前中医辨证分型以及临床病理特征,包括性别、年龄、肿瘤部位、大小、大体分型、浸润深度、Lauren分型、组织学分级、神经侵犯、脉管侵犯、幽门螺旋杆菌感染及淋巴结转移（LNM）等。应用H＆E染色光镜下及CD66b免疫组化检测判断中性粒细胞,以10个TANs/高倍视野（high power field,HPF）为临界值,将患者分为高TANs组、低TANs组。收集患者入院时血常规检查中性粒细胞和淋巴细胞计数,计算中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR）,以NLR的中位数作为临界值,将这些患者分为NLR高水平组和低水平组。探讨中医辨证分型与临床病理特征、TANs及NLR的相关性。结果:共257例T1b早期胃癌纳入本部分研究。257例患者术前中医分型为气滞血瘀证（194例,75.5%）、肝气犯胃证（9例,3.5%）、胃热伤阴证（6例,2.3%）、痰湿凝结证（14例,5.4%）、脾胃虚寒证（8例,3.1%）和气血亏虚证（26例,10.1%）。胃癌辨证分型与性别、年龄、肿瘤部位、大小、大体分型、浸润深度（SM1 vs SM2）、Lauren分型、组织学分级、神经侵犯、脉管侵犯、幽门螺旋杆菌感染以及淋巴结转移等均不存在显著相关性（P＞0.05）;胃癌辨证分型与TANs、外周血中性粒细胞/淋巴细胞比值亦不存在相关性（P＞0.05）。结论:早期胃癌的中医辨证分型与其临床病理特征无显著相关,中、西医两种评价体系间的内在联系尚需进一步研究。第二部分:肿瘤相关中性粒细胞促进早期胃癌淋巴结转移的临床病理研究目的:探讨肿瘤相关中性粒细胞在早期胃癌（EGC）中的临床病理意义,尤其是与淋巴管浸润以及淋巴结转移的相关性。方法:回顾性研究南京中医药大学附属医院（江苏省中医院）2011年1月到2020年12月接受根治性手术治疗的早期胃癌（浸润粘膜层或粘膜下层）病例,收集患者临床病理资料,包括性别、年龄、肿瘤部位、大小、大体分型、浸润深度、Lauren分型、组织学分级、神经侵犯、脉管侵犯、幽门螺旋杆菌感染及淋巴结转移（LNM）等。应用H＆E染色光镜下及CD66b免疫组化检测判断中性粒细胞,以10个TANs/HPF为临界值,将患者分为高TANs组、低TANs组。应用H＆E染色光镜下及D2-40免疫组化检测确定淋巴管浸润（lymphatic invasion,LI）。分析TANs与临床病理特征、LI的相关性。结果:本部分研究共纳入413例早期胃癌病例,其中T1a 156例、T1b 257例。共有70 例发生 LNM,其中 T1a 患者 LNM 为 5.8%（9/156）,T1b 患者 LNM 为 23.7%（61/257）。单因素分析显示,肿瘤大小（P=0.003）、浸润深度（P=0.000）、Lauren分型（P=0.000）、组织学分级（P=0.001）、LI（P=0.000）、神经浸润（P=0.011）、TANs（P=0.000）与早期胃癌LNM显著相关,其中组织学分级（P=0.026）、LI（P=0.000）和TANs（P=0.013）是早期胃癌LNM发生的独立危险因素。依据浸润深度进行分层分析。单因素分析显示,浸润深度（P=0.014）、Lauren 分型（P=0.000）、组织学分级（P=0.000）、LI（P=0.000）、高 TANs（P=0.000）与 T1b 胃癌 LNM 显著相关,其中 Lauren 分型（P=0.007）、LI（P=0.000）、高TANs（P=0.002）是T1b胃癌LNM发生的独立危险因素;肿瘤直径（P=0.049）、Lauren 分型（P=0.000）、组织学分级（P=0.017）、LI（P=0.000）和高 TANs（P=0.000）与T1b-SM2 胃癌 LNM 相关,其中 Lauren 分型（P=0.025）、LI（P=0.000）和高 TANs（P=0.003）是T1b-SM2肿瘤LNM的独立因素。但TANs不是T1a、T1b-SM1胃癌LNM独立危险因素。T1a肿瘤中几乎未见LI,LI主要发生在T1b肿瘤。TANs是T1b、SM1和SM2肿瘤LI的独立危险因素。LI中部分可检测到中性粒细胞即淋巴管肿瘤细胞-中性粒细胞簇形成。T1b和SM2肿瘤癌栓中伴随TANs的比例分别为46.97%（31/66）和45.61%（26/57）;与LI 中无 TANs 患者的 LNM 相比[T1b 胃癌 LNM 42.86%（15/35）,SM2 胃癌 LNM 41.94%（13/31）],LI 伴有 TANs 的 T1b 胃癌患者 LNM 增加到 77.42%（24/31）（P=0.006）、SM2 胃癌患者 LNM 增加到 80.77%（21/26）（P=0.003）。结论:TANs是早期胃癌淋巴结转移的独立危险因素,尤其是T1b-SM2胃癌;癌栓伴随TANs组的LNM率更为显著。TANs可促进早期胃癌淋巴结转移,其机制待进一步研究。第三部分:肿瘤相关中性粒细胞促进早期胃癌侵袭转移的分子机制研究目的:临床病例研究提示胃癌TANs可促进胃癌淋巴结转移,本部分研究目的在于探讨其分子机制。方法:（1）外周血中性粒细胞的分离培养,进行以下2组处理:①外周血中性粒细胞分离后单独培养后收集培养基（condition mediums,CMs）,②外周血中性粒细胞分离后与人胃癌细胞系MKN28或MKN45细胞共培养后,获得肿瘤细胞处理后中性粒细胞（tumor-educated neutrophils,Edu-Neu）,Edu-Neu 继续培养后收集培养基（condition mediums of Edu-Neu,CMs of Edu-Neu）。（2）应用划痕实验、Transwell小室检测细胞迁移、侵袭能力。（3）应用RNA-seq检测肿瘤细胞处理后中性粒细胞基因表达谱的变化,并进行生物信息学分析。（4）应用免疫印迹法（Western blot）、免疫荧光（Immunofluorescence assay）、免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）及实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测相关蛋白及其mRNA表达,包括上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白 E-钙粘蛋白（E-cadherin,E-cad）、ZO-1、Claudin-1、波形蛋白（vimentin,Vim）、N-钙粘蛋白（N-cadherin,N-cad）以及相关转录因子（ZEB1、Snail、Slug、Twist和β-Catenin）;TANs标志物CD66b;通路相关蛋白（JNK通路、Smad通路）以及RNA-seq结果相关蛋白（FAM3C、整合素）等。（5）应用蛋白质相互作用STRING网站预测整合素结合的蛋白,应用免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,Co-IP）进行验证。（6）建立胃癌异体移植瘤模型:将4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为两组（皮下移植瘤组及腹腔移植瘤组）,每组12只。鼠胃癌细胞系MFC细胞（1.0×106细胞/只）接种于小鼠季肋部皮下或腹腔。每组进一步分为2个亚组（抗Ly6G抗体抑制中性粒细胞组、IgG2a対照组）。2周后,观察瘤体大小,检测肿瘤细胞形态及EMT状态。结果:（1）健康供体或胃癌患者外周血中性粒细胞单独培养后的CMs对胃癌细胞迁移和侵袭性能力无影响;而Edu-Neu具有促进胃癌细胞迁移和侵袭性的能力。（2）RNA-seq检测Edu-Neu有7531个共同差异表达基因,其中上调基因6698个,下调基因833个。对差异表达基因进行GO分析及KEGG通路分析,肿瘤细胞处理后可导致中性粒细胞发生明显的分子改变。进一步生信分析提示,在“分子功能”的“细胞因子活性”类别中有47个差异表达基因,其中上调最多的4个基因为4个基因是生长分化因子15（growth differentiation factor 15,GDF15）、巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）、骨形态发生蛋白 4（bone morphogenetic protein 4,BMP4）与序列相似家族 3 成员 C（family with sequence similarity 3 member C,FAM3C）。（3）Edu-Neu 的CMs能降低 MKN28和MKN45细胞 E-cad、ZO-1、Claudin-1 表达,而增加Vim、N-cad表达。肿瘤组织研究显示,高TANs组肿瘤组织或淋巴管癌栓中E-cad表达量显著低于低TANs组（P＜0.01）,且在高TANs组,淋巴管癌栓的E-cad表达水平比周围原发灶肿瘤组织进一步减少（P＜0.01）。（4）中性粒细胞源性FAM3C促进肿瘤细胞发生EMT。FAM3C可降低MKN45和MKN28细胞E-cad的表达、增加Vim的表达,且呈剂量依赖性;GDF15、MIF和BMP4无类似作用。FAM3C中和抗体可逆转Edu-Neu诱导的肿瘤细胞侵袭能力和EMT;胃肿瘤组织及癌栓内TANs表达FAM3C,而正常胃组织中性粒细胞仅少量表达。TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库分析显示胃肿瘤组织中FAM3C mRNA水平高于正常组织（P＜0.001）;肿瘤中FAM3C水平与胃癌TNM分期相关,但未见显著性差异（P=0.063）;肿瘤中FAM3C水平与胃癌患者累积生存率呈负相关（P=0.022）。进一步研究显示,FAM3C通过激活JNK-ZEB1/Snail信号通路促进胃癌细胞发生EMT。（5）胃癌细胞通过TGFβ1促进中性粒细胞表达FAM3C。RNA-seq提示,转化生长因子受体相关蛋白 1（transforming growth factor beta receptor associated βrotein 1,TGFBRAP1）在Edu-Neu中表达增加（P=0.000）。TCGA数据分析显示,胃癌组织中TGFβ1 mRNA水平与TNM分期呈正相关（P=0.0043）、与总生存率呈负相关（P=0.022）;胃癌组织中TGFβ1 mRNA水平与FAM3C水平呈正相关（P=0.0023）。外源性TGFβ1可上调中性粒细胞FAM3C水平,应用TGFβ1抑制剂Disitertide或TGFβ1受体（TGFβ1R）抑制剂LY-364947可下调Edu-Neu的FAM3C表达,逆转Edu-Neu诱导的肿瘤细胞EMT状态。进一步研究显示,肿瘤细胞通过TGFβ1-Smad2/3途径上调TANs中FAM3C的表达。（6）RNA-seq 分析显示,Edu-Neu整合素 α2、α3、α6、αE、αv、β1、β4、β5、β6 和β8等亚基表达上调,其中α6（ITGA6）、β1（ITGB1）和β4（ITGB4）亚基增加最显著。与MKN45细胞共培养后,α6、β1和β4亚基表达上调,而TGFβ1抑制剂Disitertide或TGFβ1受体（TGFβ1R）抑制剂LY-364947可抑制其表达。外源性TGFβ1可增加中性粒细胞中α6、β1和β4亚基的mRNA水平。（7）蛋白-蛋白相互作用预测显示,ITGA6、ITGB1和ITGB4可与CD151相互作用。Edu-Neu或FAM3C处理可提高MKN45细胞的CD151表达水平。TCGA数据分析显示,胃癌组织中CD151 mRNA水平与FAM3C水平呈正相关（P=0.000）;CD151 mRNA水平与胃癌患者总生存期呈负相关（P=0.023）。Co-IP检测显示,ITGA6、ITGB1和ITGB4可与CD151结合。免疫组化双染法显示,胃癌原发灶和淋巴管癌栓内TANs表达ITGA6,同时在肿瘤细胞中可检测到CD151蛋白。（8）皮下移植瘤模型研究显示,应用抗Ly6G抗体抑制中性粒细胞功能后,肿瘤体积显著小于对照IgG组（P＜0.01）;免疫组化检测显示,与对照组相比,抗Ly6G处理组E-cad上调、Vim下调。腹腔移植瘤模型中,抗Ly6g处理组E-cad表达上调,Vim表达下调;IgG对照组肿瘤细胞呈梭形改变,肿瘤细胞破坏肝包膜浸润肝脏,而Ly6G处理组肿瘤细胞呈多边形,肿瘤未浸润肝脏,肝包膜完整。结论:中性粒细胞与肿瘤细胞之间的相互作用是促进肿瘤侵袭的先决条件,肿瘤细胞处理后的中性粒细胞促进肿瘤细胞发生EMT,增加其侵袭能力,进而促进淋巴结转移。本研究深化了对胃癌淋巴结转移机制的认识,有望为胃癌淋巴结转移的预防和治疗提供了新的策略。