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为了建立促进石斛种子萌发生长的组培快繁体系，探讨组织培养过程中组培苗的遗传差异性，并从DNA分子水平对石斛属植物进行鉴定，本试验研究了种子成熟与否、天然添加物、激素等对石斛生长发育的影响，并且利用ISSR分子标记技术初步探索了石斛种间、同种石斛不同蒴果间、同种石斛同一蒴果不同植株间及同种石斛不同几代次数间组培苗的遗传差异性。同时，采用改良CTAB法提取石斛基因组DNA，对来自石斛属的15种36份材料及1份外类群材料的线粒体NADH脱氢酶亚基1编码基因(nadl)内含子2(intron2)基因的全长序列进行测序，运用Bioedit、MEGA、DAMBE等生物软件分析石斛属植物线粒体NADH nadl intron2基因的碱基组成、变异位点和遗传距离等序列特征。研究结果如下:
(1)以成熟种子为外植体，在1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+10％土豆+琼脂6g/L+蔗糖30g/L培养基中，铁皮石斛和金钗石斛组培苗分化速率高;在1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+10％土豆+琼脂6g/L+蔗糖30g/L培养基中叠鞘石斛组培苗分化速率高。在1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L+10％土豆+琼脂6g/L+蔗糖30g/L培养基中，铁皮石斛和金钗石斛组培苗长势最好;在1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+10％土豆+琼脂6g/L+蔗糖30g/L培养基中叠鞘石斛组培苗继代生长长势良好，苗壮根多，可有效缩短整个培养周期。
(2)ISSR标记检测表明:铁皮石斛、叠鞘石斛和金钗石斛三种石斛组培苗种间多态性位点百分率为80.59％，相似系数为0.32，在物种水平上遗传多态性处较高水平。铁皮石斛与金钗石斛的遗传距离最小，为0.4055;铁皮石斛与叠鞘石斛的遗传近距离次之，为0.9651;金钗石斛与叠鞘石斛的遗传距离最大，为1.0986。
(3)在同种石斛不同蒴果间，金钗石斛组培苗间遗传差异性最大，多态性位点百分率为77.78％，铁皮石斛次之，为58.82％，叠鞘石斛最低，为28.57％。造成这一现象的原因可能是金钗石斛蒴果数量最多、铁皮石斛次之、叠鞘石斛数量最少。相应的，不同蒴果间的遗传距离分别为0.3380、0.3014、0.1905。
(4)同种石斛同一蒴果不同植株间亦存在遗传差异性，金钗石斛不同植株间多态性位点百分率为最大，为25.00％，叠鞘石斛次之，为11.11％，铁皮石斛最小，为7.14％。它们之间的遗传距离分别为:0.2071、0.0471、0.0296。
(5)铁皮石斛、叠鞘石斛和金钗石斛三种石斛组培苗在四次继代培养过程中电泳条带带型一致，并未发生质的变化，认为没有发生遗传变异。
(6)石斛属线粒体nad1intron2序列全长约845bp，其中有变异位点72个，信息位点12个，且接近3端的序列上变异性较大，5端相对保守一些。
(7)不同种石斛在线粒体nad1 intron2基因位点上变异情况有所不同。通过nad1 intron2基因序列可以鉴别除美花石斛、长苏石斛、紫皮石斛、霍山石斛外的11种石斛属植物:铁皮石斛、黑毛石斛、细叶石斛、金钗石斛、束花石斛、叠鞘石斛、曲茎石斛、球花石斛、尖刀唇石斛、鼓槌石斛、细茎石斛。金钗石斛、细叶石斛种内不同居群间遗传距离为0，没有碱基差异。但对叠鞘石斛来说，不仅不同居群间该基因序列有所不同，同一居群不同株系的序列也存在碱基差异。因此，线粒体NADH nad1 intron2基因作为石斛属植物分子鉴定方法具有一定的可行性。