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研究背景在世界范围内每年大约有一百万人被诊断为胃癌,其中东亚地区属于胃癌的高发区域,每年约有738,000人死于胃癌,这些都使得胃癌在肿瘤发病率中位于第四并且死亡率位于第二,同时胃癌也导致过高的肿瘤经济负担。2000年后,几项大规模的对照研究显示辅助化疗对胃癌患者的生存有益。这些研究表明,胃癌切除术后接受辅助治疗的患者的生存率高于单纯接受手术的患者。随后的许多研究也发现了辅助化疗对胃癌患者的有益作用。因此,近20年来胃癌的辅助化疗得到了研究和临床的重视,已成为胃癌切除后晚期的标准治疗方案之一。对于晚期胃癌来说,含铂方案的化疗是晚期胃癌的标准治疗,但是有的患者会出现耐药,目前关于胃癌铂类耐药的具体机制还不明确,其中化疗诱导的肿瘤干细胞表达是铂类治疗失败的原因之一。因此加强对胃癌耐药机制的研究,寻找切实可行的预防治疗途径,是胃癌研究的重要方向之一。miRNAs是一种长度约为18-24个核苷酸的非编码单链小分子物质,广泛存在于真核生物中,是一组不参与蛋白编码的短序列RNA,其通过与靶基因mRNA的3′UTR结合抑制其翻译或诱导其降解,从而发挥对蛋白翻译的调控作用。到目前为止,已经发现了超过2500个miRNAs(miRbase数据库),它们的异位表达与肿瘤的增殖、侵袭、转移、生长和凋亡有关。随后越来越多的的研究也发现致瘤性miRNA(onco-miRNA)和抑瘤性miRNA(suppressor miRNA)在胃癌进展中发挥重要作用。之前的研究发现miR-492在多种肿瘤中促进肿瘤细胞的增殖、转移、耐药以及与肿瘤干细胞相关。本研究的主要目的是明确miR-492在胃癌中的表达,以及对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭以及对铂类治疗的影响,进一步具体明确miR-492的作用机制,同时为胃癌的发生、发展以及耐药提供新的视角。方法:1.胃癌组织和胃癌细胞株中miR-492表达的检测以及胃癌组织中的miR-492表达量与预后的关系采用RT-PCR的方法对胃癌组织和胃癌细胞株(SNU-5、MGC-803、AGS和SGC-7901)和胃粘膜上皮细胞系(GES-1)中miR-492的表达进行检测、定量分析。采用Kaplan-Meier曲线分析miR-492的表达量与患者OS的相关性。2.miR-492对胃癌细胞株增殖、转移、凋亡的影响及其机制采用CCK-8、流式凋亡检测、Transwell检测分别转染miR-492mimic和inhibitor后细胞的增殖转移能力;蛋白印迹、免疫荧光、流式分选、RT-PCR验证miR-492对细胞干性标志物和DNMT3B的影响;采用RT-PCR的方法对胃癌组织中miR-492和DNMT3B的表达进行检测,分析二者的相关性。3.miR-492通过DNMT3B调控胃癌细胞干性的机制采用慢病毒人为的对DNMT3B实施干扰,WB进行验证;CCK-8、流式凋亡、Transwell检测DNMT3B对胃癌细胞增殖转移能力的影响;蛋白印迹、免疫荧光、流式分选、RT-PCR验证miR-492对细胞干性标志物的影响;成球能力分析胃癌细胞系的干性。4.miR-492通过DNMT3B对胃癌耐药的影响给予裸鼠皮下注射胃癌细胞和转染了miR-492 inhibitor的胃癌细胞构建皮下移植瘤,测量肿瘤大小绘制生长曲线,流式分选检测CD133表达,免疫组化检测增殖指数。5.统计方法使用SPSS 22.0进行统计分析。计数资料用M±SD表示,计量资料用中位数和范围表示,两组间比较采用t检验,Kaplan-Meier,Log rank用于生存分析,P<0.05认为有统计学意义。结果:1.miR-492在肿瘤组织和肿瘤细胞系中处于高表达状态(P<0.05)。进一步分析了miR-492表达的高低和患者预后的关系,发现miR-492高表达与患者预后差的相关,miR-492表达越高的患者预后越差(P=0.0287)。2.miR-492促进胃癌细胞的增殖、转移和抗凋亡,并且是通过增加胃癌细胞的干性来增加增殖、转移和抗凋亡;发现miR-492对DNMT3B的表达存在调控作用,其机制是miR-492与DNMT3B的转录启动子结合抑制了DNMT3B的转录。3.DNMT3B可以抑制CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1在胃癌中的表达,减少胃癌细胞球的数量,并且miR-492通过抑制DNMT3B参与调控CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1,具体机制为:miR-492与DNMT3B的启动子结合抑制了DNMT3B的转录,DNMT3B的下调,导致CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1启动子区域的甲基化下调从而增加了CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1的转录。4.miR-492促进肿瘤生长,在抑制miR-492后肿瘤的增长被减慢(P<0.05),但是在抑制DNMT3B的表达后这一抑制现象被部分逆转。结论:1.miR-492在胃癌组织和胃癌细胞系中高表达;2.miR-492通过调控胃癌细胞干性转换增加了胃癌细胞的增殖、转移和抗凋亡能力;3.miR-492通过负向调节DNMT3B,使得后者DNMT3B对CD133、Nanog、Oct 3/4和BMI-1启动子的甲基化水平降低,导致肿瘤细胞干性增加,从而增加了胃癌细胞的增殖、转移和抗凋亡能力;4.miR-492通过DNMT3B调控胃癌细胞干性参与对顺铂的耐药。