目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发病率正在逐渐增高,研究AS及其相关疾病的发病机制和防治方法成为热点。二氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）是5α-还原酶还原睾酮双键形成的甾醇,是最具活性的雄激素。既往研究发现,生理水平的DHT可以显著减少巨噬细胞中血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1,LOX-1）的mRNA的表达,而且至少部分是通过雄激素受体（androgen receptor,AR）发挥作用的。为进一步探讨雄激素及其受体对动脉粥样硬化发生发展的作用,本课题小组前期通过酵母双杂交筛选出在男性外周血单核细胞内与AR相互作用的蛋白,得到核糖体蛋白L10（RPL10）,前B细胞白血病同源框蛋白作用蛋白1（PBXIP1）,但通过酵母双杂交并不能充分证实蛋白与蛋白间的作用,存在假阳性的可能。为此,本实验旨在利用pull down技术在体外对AR与上述蛋白的相互作用进行进一步验证,进而探讨在男性单核细胞中的蛋白与AR的相互作用的信号传导通路,可能作为辅助调节因子与AR之间存在相互作用,为动脉粥样硬化致病机制及治疗方向提供理论依据和靶点。研究方法:本研究采用基因克隆的技术,将pGADT₇-RPL10、pGADT₇-PBXIP1作为模板,设计特异性引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的片段。将RPL10、PBXIP1基因片段,克隆到利用Eco R I和Bam H I两种限制性内切酶双酶切后的含有GST标签的pGEX₄T₂载体上,构建重组质粒pGEX₄T₂-RPL10与pGEX₄T₂-PBXIP1,进行测序并分析。利用诱导剂IPTG诱导大肠杆菌表达含有GST标签的蛋白RPL10与PBXIP1,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,考马斯亮蓝染胶,脱色观察蛋白表达情况。利用pull down技术,将pGBKT₇-AR重组质粒进行体外转录翻译,作为捕获蛋白;提取在大肠杆菌中表达的RPL10与PBXIP1蛋白,作为诱饵蛋白,将其固相化到MagneGST^TMM Particles上,将两种蛋白共同孵育,洗脱,纯化,利用Western blot技术分析相互作用的蛋白复合物,化学发光法鉴定结果并分析。结果:通过PCR技术获得目的基因片段,并重组质粒GST-RPL10、GST-PBXIP1构建成功。IPTG诱导RPL10、PBXIP1融合蛋白成功表达后,用pull down和Western blot技术证实,GST-RPL10融合蛋白大小约在50KD左右,GST-PBXIP1融合蛋白大小约在52KD左右,空白对照GST蛋白大小约在26KD左右,AR-LBD融合蛋白大小约在37KD左右;两种蛋白共同孵育后分别用不同抗体检测可见GST-RPL10/PBXIP1融合蛋白在体外可以特异性的将c-myc-AR-LBD融合蛋白pull down下来,空白对照GST蛋白不能将c-myc-AR融合蛋白pull down下来。结论:通过Pull down技术进一步证实AR编码蛋白分别与RPL10、PBXIP1在体外发生相互作用。