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微生物或体外酶发酵途径降解咖啡因是今后茶产品脱咖啡因的重要研究方向之一。本文以高耐咖啡因的假单胞菌菌株CT25为研究对象,在优化基因组文库构建方法的基础上,构建了插入片段长度5-8kb的CT25基因组文库,经抗咖啡因筛选和测序获得了与降解咖啡因相关的基因簇,并采用细菌转录组测序研究了咖啡因氮源对CT25基因表达的影响。主要结果如下：采用不完全酶切法构建基因组文库时,可将2μg基因组DNA以0.2-0.4USau3AI在37℃下酶切5min,产物电泳后分段回收不同分子量的DNA片段,并与线性化和去磷酸化处理后的载体分别进行连接,再经热击法转化感受态大肠杆菌,可获得较好的文库构建效果。同时,研究还发现,采用shear仪剪切基因组DNA,经末端补平、连接载体和电转化,也可获得令人满意的建库效果。从构建的基因组文库(库容约1.5万、插入序列约5-8kb)中随机选取1000个克隆进行了咖啡因降解筛选实验,获得了7个能降解咖啡因的阳性转化子,分别为CTG-004、CTG-005、A1、A13、F17、O3、 P16。经测序和生物信息学分析显示,CTG-004上的类frataxin铁硫簇蛋白和铁硫氧化还原酶,CTG-005上的HAMP域蛋白和信号转导相关蛋白,A1上的N代谢转录调控相关蛋白,A13上的BAND7家族蛋白,F17上的叶酸代谢相关蛋白Fic/DOC,03上的自由基SAM蛋白／钼辅因子生物合成蛋白以及P16上的双能半胱氨酸脱硫酶／硒代半胱氨酸裂解酶SufS和Fe-S簇代谢蛋白SufE等基因可能与转化子降解咖啡因能力提升有关。说明CT25高耐咖啡因能力是由位于不同基因簇的信号转导、转录调控和氧化降解多个功能基因簇共同协调作用的结果。比较了以咖啡因或蛋白胨为唯一氮源/碳源的CT25细菌转录组差异,结果显示,在含咖啡因培养基中,CT25细菌通过信号转导系统感应环境N和C源变化,降低多数转录活化因子和调节蛋白表达活性,进而使大量与DNA复制和修复、物质转运、氨基酸代谢、蛋白合成、tRNA加工以及脂肪代谢等相关基因表达下调;同时,该菌通过趋化因子等感受器接受环境高咖啡因信号,经HTH转录调节子激活胁迫反应、氧化还原、N代谢、脂肪酸代谢、以及铁离子转运相关基因的表达活性,以适应高咖啡因、低营养环境。