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干扰素-τ（Interferon-τ，IFN-τ）是反刍动物在妊娠早期由胚胎滋养层细胞分泌的一类Ⅰ型干扰素，被视作妊娠识别信号，具有抗黄体溶解、抗病毒、免疫调节等多种生物学功能。其在调节胚胎着床时期子宫容受态和子宫免疫环境等方面的作用对于胚胎的顺利着床尤为重要。IFN-τ在奶牛妊娠早期，即胚胎植入窗口期，通过对牛白细胞Ⅰ类抗原(Bovine leukocyte antigen，BoLA-Ⅰ)及其他妊娠相关分子的调节，提高母体对胎儿的容受性，增加胚胎植入的成功率。BoLA-Ⅰ，是牛的主要组织相容性Ⅰ类（Major histocompatibility complex，MHC-Ⅰ）蛋白，在牛的胚胎滋养层和子宫内膜上皮细胞中均有表达，与妊娠早期母体对胎儿免疫耐受密切相关。IFN-τ也可以调节分离培养的奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达miRNAs。miRNAs普遍存在于真核生物，通过对靶基因的调节，参与机体各种生理和病理过程,在妊娠免疫和重塑子宫内环境等方面也有重要作用。 本实验室前期的研究表明，IFN-τ在奶牛妊娠早期可上调BoLA-Ⅰ的表达，并可调节奶牛子宫内膜上皮细胞中miRNAs的表达谱。通过高通量测序和分析，发现一些差异表达显著的miRNAs可能与IFN-τ调节奶牛子宫内膜上皮细胞差异表达BoLA-Ⅰ类蛋白有关。为进一步验证其相关性，也为进一步研究奶牛妊娠免疫和子宫容受性的调节机制提供实验依据，探索IFN-τ在奶牛妊娠早期协助胚胎免疫逃逸，为胚胎植入提供可能的潜在机制，本研究从验证miRNAs/miRNAs靶基因入手，展开了深入的研究，主要研究内容和结果如下: (1)从高通量测序的结果中筛选到bta-miR-145和bta-miR-204在IFN-τ作用下的奶牛子宫内膜上皮细胞中的表达明显降低。选取空怀和妊娠早期奶牛子宫内膜组织进行在体验证。RT-qPCR和Western blot检测结果表明，妊娠早期奶牛子宫内膜组织相较于空怀奶牛而言，其bta-miR-145和bta-miR-204的mRNA水平显著降低，MHC-Ⅰ类相关链（MHC classⅠ-relatedchain，MIC1）基因和Ⅰ类MHC重链(Major histocompatibility complex，classⅠ-A，BoLA)基因的mRNA水平却显著上调，且BoLA-Ⅰ蛋白水平也明显升高。 (2)分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞(bEECs)进行体外验证，结果显示，在IFN-τ(200ng/mL)作用下，和对照组相比，bEECs中bta-miR-145与bta-miR-204的mRNA水平同样下降明显，MIC1和BoLA的转录水平上升明显，BoLA--Ⅰ蛋白表达水平升高显著。 (3)利用生物信息学技术对bta-miR-145与MIC13UTR，bta-miR-204与BoLA3UTR靶序列的碱基配对情况，结合形成RNA双链的二级结构和自由能等主要生物信息学指标进行了归纳分析，初步确定MIC1为bta-miR-145的靶基因，BoLA为bta-miR-204的靶基因。通过双荧光素酶报告检测分析，发现，bta-miR-145显著抑制MIC13UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性，而bta-miR-204也能显著抑制BoLA YUTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性。确证MIC1是bta-miR-145的靶基因，BoLA是bta-miR-204的靶基因。 (4)bta-miR-145、bta-miR-204的过表达和抑制实验表明，在bEECs中转染bta-miR-145模拟物能显著抑制MIC1基因mRNA的表达;而转染bta-miR-145抑制剂后，MIC1基因mRNA的表达则显著上调。而在bEECs中转染bta-miR-204模拟物则能显著抑制BoLA基因mRNA的表达;而转染bta-miR-204抑制剂后，BoLA基因rnRNA的表达则显著上升。在IFN-τ的作用下，bEECs中MIC1和BoLA的mRNA水平显著增加，BoLA-Ⅰ的蛋白表达水平也明显上调。进一步证实了MIC1是bta-miR-145的直接靶基因，而BoLA是bta-miR-204的直接靶基因。结果证明，IFN-τ可以通过对bta-miR-145和bta-miR-204的负调节作用，提高MIC1和BoLA的表达。 (5)为了验证IFN-τ在胚胎植入期对细胞外基质和免疫微环境的影响，采用RT-qPCR分析了未孕和妊娠早期奶牛子宫内膜组织中崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白10(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein10,ADAM10),崩解素与金属蛋白酶结构域蛋白17(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein17，ADAM17)，程序性细胞死亡配体1（Programmed cell death-ligand1，PD-L1）和程序性细胞死亡配体2(Progammed cell death-ligand2，PD-L2)的mRNA水平。结果表明，妊娠早期奶牛子宫内膜组织中的ADAM10，ADAM17，PD-L1及PD-L2的mRNA水平都有不同程度的升高。而在IFN-τ的作用下，bEECs中ADAM10，ADAM17，PD-L1与PD-L2的mRNA水平都有明显的增加。 (6)为了验证IFN-τ是否通过对MIC1和BoLA的调节来影响ADAM10，ADAM17，PD-L1及PD-L2的表达，采用siRNA干扰技术在bEECs中进行体外验证。结果表明，siRNA干扰MIC1的表达后，ADAM10和ADAM17mRNA水平明显下降;在bEECs中转染BoLA siRNA后，PD-L1与PD-L2的mRNA水平也显著下调。结果提示，IFN-τ通过bta-miR-145对MIC1的调节影响ADAM10和ADAM17的表达;同时可通过bta-miR-204对BoLA的调节作用，来调节PD-L1与PD-L2的表达，从而对细胞外基质和免疫耐受等多方面的调节来影响胚胎植入。 (7)进一步验证IFN-τ对胚胎植入的影响，建立了LPS诱导的小鼠胚胎植入障碍模型，进行在体验证。实验结果表明，IFN-τ能提高LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量，同时FN-τ也能抑制LPS诱导的炎性因子IL-1β和TNF-α的表达，并上调抗炎因子IL-10的表达。 结论: (1)MIC1是bta-miR-145的靶基因，BoLA是bta-miR-204的靶基因。 (2)IFN-τ通过抑制bta-miR-145上调MIC1的表达来增加ADAM10和ADAM17的表达，以影响细胞外基质，促进胚胎黏着、侵袭等过程。 (3)IFN-τ通过抑制bta-miR-204上调BoLA的表达来提高PD-L1与PD-L2的表达，以此影响母胎界面的免疫微环境，促进胎儿免疫逃逸。 (4)IFN-τ通过下调bta-miR-145/204的表达来调节BoLA-Ⅰ类相关分子的表达和功能，以增加胚胎植入的成功率。 (5)IFN-τ通过对免疫平衡的调节来增加LPS导致的小鼠胚胎植入减少的数量。