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富血小板纤维蛋白(platelet-richfibrin,PRF)即为第二代浓缩血小板制剂。PRF富含各类生长因子,作为辅助添加成分,常用于口腔、骨科、创伤等科室。相比第一代浓缩血小板制剂富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP),PRF具有自身独特的生物学特征。自体脂肪移植作为当今整形外科医生的常用技术,已有百年历史。自体脂肪移植具有操作相对简单、脂肪易于获取且获取量足、自体组织无免疫原性等优点,常用于治疗组织容积缺失。脂肪的获取、处理和注射过程被认为是影响术后脂肪保留率的主要因素。方便脂肪移植的机械细化操作便是脂肪处理的环节之一。受以上潜在因素影响,自体脂肪移植术后存在不同程度的坏死、吸收,影响填充脂肪的体积保留率。近来,通过添加辅助成分来改善脂肪移植效果成为研究热点之一。既往文献报道的辅助成分包括化学物质、生长因子、脂肪干细胞、血管基质成分和浓缩血小板制剂等。目的对富血小板纤维蛋白的生物学特征进行研究,包括大体观察、结构组分分析和体外因子释放研究,并在动物实验中对富血小板纤维蛋白联合不同形态脂肪移植的效果进行评价和比较。方法使用一次性人体静脉血样采集容器从健康志愿者肘部静脉抽取20ml血液。取完血样后,立即置入普通台式离心机中,以3000rpm/10min进行离心。首先大体观察获得的PRF。然后,将PRF和压膜后的膜片分别固定于戊二醛溶液中,行电镜扫描观察其结构和细胞组份。另外将相应例数的PRF用细胞培养基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)进行体外培养,收集10个时间点的样本,用悬浮芯片法测定PRF体外因子释放情况。体内实验采用的是本团队前期建立的免疫缺陷裸小鼠动物缝合模型。实验分为乳糜脂肪组和颗粒脂肪组。乳糜脂肪组的实验组和对照组分别是乳糜PRF和乳糜NS,颗粒脂肪组的实验组和对照组分别是颗粒PRF和颗粒NS。乳糜脂肪和颗粒脂肪分别以5:1的比例与PRF混合。单个缝合圈的注射量为0.2ml。脂肪移植术后4周,8周,12周分别取材。通过移植物湿重称量、体积测量对乳糜脂肪组和颗粒脂肪组的移植物进行评价比较;活体组织块Whole-Mount染色共聚焦显微镜直观观察、即时评价移植物剖面脂肪细胞的存活情况;HE评价各取材时间点移植物的微观结构;Perilipin染色评价各取材时间点移植物的脂肪细胞存活数目;α-SMA染色评价各取材时间点移植物的血管计数。结果1.扫描电镜结果发现,PRF上段为交联的纤维蛋白立体空间结构,细胞成分较少。PRF中段仍为紧密交联的纤维蛋白立体空间结构,其中见中等量细胞成分,包括血小板、白细胞和少量红细胞。PRF下段可见大量细胞成分分布,包括血小板、白细胞和红细胞。2.扫描电镜观察压膜膜片发现,相比压膜前,压膜后纤维蛋白空间结构更加致密,细胞成分不容易观察到。截面可以观察到,上段结构最为致密,中段次之,下段相对疏松。3.悬浮芯片法测定结果发现,选定的7种因子随时间变化均有不同程度的释放。选定的7种因子,在28天的释放周期内,均已达到释放平台期。因子释放总量由多到少依次是 CXCL8、PDGF-BB、Angiopoietin-2、TNF-alpha、VEGF-A、EGF 和FGF-basic。4.从时间节点释放量观察发现,CXCL8、PDGF-BB、Angiopoietin-2、TNF-alpha、VEGF-A、EGF和FGF-basic的释放峰值分别位于第3天、第1天、第1天、第2天、第1天、第1天、第4天。从累计释放曲线观察发现,CXCL8、PDGF-BB、Angiopoietin-2、TNF-alpha、VEGF-A、EGF 和 FGF-basic 进入释放平台期的时间分别位于第20天、第20天、第20天、第8天、第20天、第12天、第12天。5.体内动物实验结果证实,4周、8周、12周时,乳糜NS组和颗粒NS组脂肪移植物的重量、体积、体积保留率差异不存在统计学意义(p>0.05)。各取材时间点上,从共聚焦显微镜观察、HE评分、脂周蛋白阳性脂肪细胞数、血管计数4方面进行评价,乳糜NS组均优于颗粒NS组,两组之间的差异存在统计学意义(p<0.05)。6.体内动物实验结果证实,4周、8周、12周时,乳糜PRF组和颗粒PRF组脂肪移植物的重量、体积、体积保留率均与乳糜NS组和颗粒NS组存在差异,且差异存在统计学意义(p<0.05)。各取材时间点上,从共聚焦显微镜观察、HE评分、脂周蛋白阳性脂肪细胞数、血管计数4方面进行评价,实验组和对照组之间差异存在统计学意义(p<0.05)。7.体内动物实验结果证实,4周、8周、12周时,乳糜PRF组和颗粒PRF组脂肪移植物的重量、体积、体积保留率差异不存在统计学意义(p>0.05)。各取材时间点上,从共聚焦显微镜观察、HE评分、脂周蛋白阳性脂肪细胞数、血管计数4方面进行评价,乳糜PRF组均优于颗粒PRF组,两组之间的差异存在统计学意义(p<0.05)。结论1.PRF具有致密的纤维蛋白结构,细胞成分呈节段性分布特点。从上段、中段至下段,细胞数量逐渐增多。2.PRF压膜后结构更加致密,细胞成分不容易观察到。其上段结构最致密,中段次之,下段相对疏松。3.PRF含有包括VEGF-A、PDGF-BB、FGF-basic在内的多种血管生成相关因子,体外具有缓释目标因子的作用。4.PRF体外释放测定因子均于1周内出现释放峰值、3周内进入释放平台期,释放峰值时间和进入平台期时间因因子而异。5.机械细化处理吸脂混合物,能明显改善移植术后的脂肪组织学形态,但对脂肪移植物的重量、体积及体积保留率影响与处理前无差异。6.PRF联合乳糜脂肪和颗粒脂肪进行脂肪移植,均能有效改善移植术后的脂肪组织学形态,提高脂肪移植物的重量、体积及体积保留率。7.PRF联合乳糜脂肪进行脂肪移植,术后脂肪组织学形态改善要优于PRF联合颗粒脂肪,但对两者移植物的重量、体积及体积保留率影响无差异。