研究背景:核转录因子Kappa B(NF-κB)作为一种重要的转录因子参与了多种基因的调控。哺乳动物NF-κB家族由5种蛋白质组成:NF-κB 1(p50及其前体p105),NF-κB 2(p52 及其前体 p100),ReIA(p65),ReIB 和 c-Rel。NF-κB一般以成员间形成同源或者异源二聚体的形式存,静息状态在细胞质中与通路抑制蛋白IκB结合。通常所指的NF-κB为p50/p65异源二聚体,儿乎存在于所有细胞且含量最高,而其他二聚体含量极少。当受到特定刺激时,IκB被降解,NF-κB信号通路活化,游离的p65磷酸化并入核与相应DNA序列结合诱导靶基因的转录。所以通常认为,NF-κB p65是NF-κB信号通路的核心,而磷酸化p65的水平即可反映NF-κB信号通路的活化程度。甲状腺乳头状癌(PTC)和胃癌(GC)均为上皮细胞来源的恶性肿瘤,在肿瘤的发生发展过程中有许多相似之处。多项研究表明,NF-κB信号通路在PTC及GC中异常活化,且可通过调节多种因子的转录促进肿瘤细胞的增殖及侵袭。第一部分NF-κB信号通路在MMP-11促进甲状腺乳头状癌细胞增殖及侵袭中的作用研究背景:甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤,约占美国每年新增癌症诊断数的1.7%。在世界范围内,由于诊断技术的提高和生活方式的改变,甲状腺癌发病率在过去30年中增加了三倍。甲状腺乳头状癌(PTC)是其最常见的病理亚型,占所有甲状腺癌的85%。虽然通过甲状腺切除和放射性碘的组合治疗,大部分的PTC患者得以痊愈,然而这种治疗通常不能治愈具有侵略性临床特征的病例。因此,更好地了解PTC发展的分子机制将有助于新治疗方式的发现。基质金属蛋白酶-11(MMP-11,stromelysin-3)是基质金属蛋白酶家族(MMPs)中的一员,与MMP家族的一些成员类似,MMP-11在多种实体肿瘤组织的标本中表达增高,且与癌症细胞的生物学功能相关。虽有文献报道MMP-11在PTC中高表达,但其对PTC细胞的生物学功能的影响及相关机制还未有阐述。本研究将通过组织样本中MMP-11水平检测及体外细胞实验,探究MMP-11对PTC细胞生物学行为的作用及相关机制,以期为PTC的临床治疗提供新的潜在靶点。第一节MMP-11与PTC的临床相关性及生物学研究研究目的1.比较分析MMP-11在PTC组织及对应正常癌旁组织中的表达差异。2.探究MMP-11对PTC细胞生物学功能的影响。研究方法1.选取5对PTC及远端癌旁组织,运用人类全基因组表达谱芯片技术比较MMP家族的表达差异情况。2.选取30对PTC及远端癌旁组织,运用PCR及Western Blot技术分析MMP-11的表达差异。3.将MMP-11的小干扰RNA及高表达质粒分别转染PTC细胞系,细胞划痕实验检测转染细胞迁移能力。4.cck-8实验检测转染细胞增殖能力。5.transwell细胞侵袭实验检测转染细胞侵袭转移能力。研究结果1.基因微阵列芯片结果表明,MMP-11在PTC组织中的mRNA表达水平显著高于癌旁组织(>10倍),是MMP家族表达差异最大的基因,同时也是所测2万余基因中差异最大的基因之一。2.PCR及Western Blot结果显示,PTC中MMP-11的mRNA及蛋白表达水平均高于癌旁组织,且具有显著差异。3.细胞划痕实验结果显示MMP-11对PTC细胞系(K1,BCPAP)的迁移能力无明显影响。4.cck-8实验结果显示MMP-11的表达水平与PTC细胞系的增殖能力呈正相关。5.细胞侵袭实验结果显示,MMP-11的表达水平与BCPAP的侵袭能力呈正相关,但对K1的侵袭能力无明显影响。结论及意义本节实验结果表明,MMP-11在PTC组织中的表达水平显著高于癌旁组织;可明显提升PTC细胞的增殖及侵袭能力,这提示MMP-11在PTC的发展中起到促进作用。第二节MMP-11调控PTC细胞功能的分子机制研究研究目的探究MMP-11增强PTC细胞增殖及侵袭能力的相关细胞信号传导通路。研究方法1.运用Western Blot技术检测筛选MMP-11 可能调控的相关蛋白。2.对转染细胞筛选的相关信号通路进行干扰,并进行回复实验。3.将NF-κB reporter导入转染细胞,通过双荧光素酶法进一步确定MMP-11与NF-κB的上下游调控关系。研究结果1.Western Blot结果显示,抑制MMP-11后,转录因子p65的磷酸化水平(p-p65)降低,其下游的调控因子细胞周期蛋白cyclin D1及侵袭因子MMP-9的表达均降低。2.使用p65小干扰RNA抑制NF-κB信号通路,对照组与MMP-11过表达组的细胞增殖及侵袭能力均无明显差异。3.双荧光素酶实验结果显示,NF-κB reporter荧光强度随着MMP-11的表达增高而增强。结论及意义MMP-11可通过促进转录因子p65的磷酸化,增加cyclin D1的表达从而促进PTC细胞的增殖,亦增加了 PTC细胞系BCPAP中MMP-9的表达促进其侵袭。本节实验表明MMP-11可以通过NF-κB信号通路促进PTC的发展,这为PTC的进展机制的研究提供了新的思路,为PTC的治疗提供了新的潜在靶点。第二部分NF-κB信号通路参与调控胃癌细胞中长链非编码RNA HOTAIR的表达研究背景:胃癌(GC)是最常见的恶性肿瘤之一,约占全球所有侵袭性癌症的10%,癌症致死数排全球第三,每年新确诊病例约100万。我国是胃癌高发国家,胃癌发病数和死亡数分占全球的42.6%和45.0%。虽然诊断技术及医疗水平有所提高,胃癌五年生存率仍只有30%～50%,了解其发病机制以寻找更有效的治疗方法显得尤为重要。长链非编码RNAs(IncRNAs)是一类新发现的长度大于200 nt非编码RNA。它们虽然不编码蛋白质,但可以在多个水平上调节某些基因的表达,从而影响细胞功能。近年的研究表明,IncRNAs的异常表达与多种肿瘤的发生密切相关。同源盒转录反义RNA(HOX transcript antisernseRNA,HOTAIR)是第一个被发现具有反式作用IncRNA,多项研究表明,HOTAIR在胃癌病变组织的表达明显高于正常组织,其参与胃癌细胞免疫逃避、上皮间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)、化疗抵抗等,从而促进胃癌的发展。关于HOTAIR在胃癌细胞中的表达异常的机制研究较少,本研究将从分子水平探讨HOTAIR的表达机制,寻找HOTAIR的转录因子及结合位点,以期为今后的相关研究提供理论基础。研究目的1.比较分析HOTAIR在胃癌发生发展不同阶段的表达情况。2.探究HOTAIR对胃癌细胞增殖能力的影响。3.找出与HOTAIR基因结合的转录因子,并确定其与HOTAIR启动子的结合位点。研究方法1.消化内镜夹取5例正常胃粘膜,12例浅表性胃炎(SG),12例萎缩性胃炎(AG),6例非典型增生(AH)和12例胃癌组织的新鲜标本,运用PCR技术分析HOTAIR的表达差异。2.通过导入小干扰RNA沉默HOTAIR在胃癌细胞系AGS的表达,平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化,PCR检测增殖相关蛋白的表达变化。3.结合NCBI Genbank数据库中的启动子预测结果,构建10组HOTAIR基因启动子截短片段的pGL3-basic重组质粒并导入AGS细胞,双荧光素酶报告实验检测缺失片段的启动子活性。4.通过TRANSFAC软件协助分析潜在的转录因子及结合位点。5.提取NF-κB信号通路抑制因子肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样因子2(TIPE2)基因敲除小鼠新鲜组织,PCR实验检测HOTAIR的表达变化。6.TIPE2质粒导入胃癌细胞系AGS,BGC-823和MGC-803,Western Blot实验检测p-p65的表达变化,PCR实验检测HOTAIR的表达变化。7.p65小干扰RNA沉默AGS,BGC-823 和MGC-803,Western Blot实验检测p-p65的表达变化,PCR实验检测HOTAIR的表达变化。8.染色质免疫共沉淀(CHIP)实验确定p65与HOTAIR启动子的结合位点。研究结果1.PCR结果显示,HOTAIR在SG的表达与正常对照组无明显差异而在AG,AH和GC组织表达明显增高。有趣的是,与AH和GC相比,AG组织具有更高水平的HOTAIR表达。2平板克隆形成实验结果显示,HOTAIR表达抑制后,集落形成率显著降低,细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子(CDKI)p27的表达水平显著提高。3.双荧光素酶报告实验结果显示,-475/+ 57bp片段荧光素酶活性明显高于-443/+57bp 片段。4.TRANSFAC软件分析HOTAIR的转录可能与NF-κB信号通路有关。5.TIPE2基因消除小鼠胃、肾及肠组织HOTAIR的表达较对照组明显升高。6.增强TIPE2后,胃癌细胞中p65的磷酸化和HOTAIR的表达水平明显降低。7.沉默P65后,胃癌细胞中p65的磷酸化和HOTAIR的表达水平明显降低。8.CHIP实验结果显示,p65组HOTAIR cDNA扩增倍数水平明显高于lg g对照组。结论及意义本部分实验结果表明,HOTAIR在AG,AH及GC组织中的表达水平显著高于正常组织,且HOTAIR可通过抑制p27的表达促进胃癌细胞的增殖,这说明HOTAIR可能在胃癌的进展中起到重要作用。通过进一步研究,我们发现转录因子NF-κB p65可与HOTAIR基因启动区-475 to～-443bp中的启动序列5’GAGTTTCCCT3’结合,从而起始HOTAIR的转录过程,而TIPE2可通过降低p65的磷酸化水平从而减少HOTAIR的合成。促癌基因HOTAIR转录因子及其结合位点的发现,进一步阐明了HOTAIR合成的分子机制,为今后的相关研究提供了理论基础。