酱油是我国传统的调味品,其发酵的主要菌种是米曲霉。米曲霉分泌的多种酶系能利用原料中碳氮等大中分子物质,最终形成具有多种风味物质的产品。酱油挥发性风味物质成分复杂,可分为醇酚类、酸类、酯类、醛类、呋喃类等。蛋白酶作为米曲霉分泌的重要酶,能在发酵过程中分解原料、生成氨基态氮,从而影响酱油的风味和品质。目前,关于酱油中主要挥发性风味物质的测定分析多集中在成品酱油,对于发酵过程中的挥发性风味物质变化鲜有探究,且少有研究涉及关于酱油发酵过程中米曲霉蛋白酶分泌情况,对蛋白酶的表达利用并不了解。本课题模拟米曲霉单菌种发酵高盐稀态酱油过程,旨在研究酱油发酵过程中具体挥发性风味物质的变化情况,探究米曲霉所分泌的蛋白酶在酱油酿造过程中的表达情况,分离纯化酱醪中米曲霉蛋白酶并进行酶学性质研究。主要结果如下:1. 为了探究米曲霉发酵高盐稀态酱油过程中挥发性风味物质的种类及含量变化情况,采用SPME-GC-MS方法检测米曲霉发酵高盐稀态酱油过程中酱醪挥发性风味物质。结果表明,发酵0⁶个月过程中,酱醪挥发性风味物质在发酵前期以醇酚类、醛类为主,发酵中期以醇酚类、酸类、醛类为主,发酵后期以醇酚类、酸类、酯类、含氮化合物为主。其中,乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯甲醛和苯乙醛是重要的挥发性风味物质组成,与12种市售高盐稀态酱油重要的挥发性风味物质成分相符,这些物质使酱油具有相似的风味。2.为了进一步了解酱醪在发酵0⁶个月过程中米曲霉蛋白酶分泌情况,利用Label free非标记定量技术对发酵0个月、2个月、6个月酱醪盐析所得酶液进行蛋白质组学测定。结果表明,随着发酵进行,蛋白酶种类和表达量均呈递减状态,米曲霉分泌蛋白酶水平呈下调趋势,中性蛋白酶II可能是酱油发酵过程中关键蛋白酶,对风味形成有重要影响。3.通过硫酸铵盐析、阴离子交换层析、凝胶层析分离纯化酱醪中米曲霉蛋白酶,得到相对分子大小约为50 k Da、电泳纯度的蛋白酶。纯化所得蛋白酶比酶活为460.53 U/mg,酶活收率为1.70%,纯化了5.70倍。4.测定纯化蛋白酶的酶学性质,包括最适p H、最适温度、热稳定性、金属离子对蛋白酶活力影响。结果表明,纯化蛋白酶作用的最适p H为7,属于中性蛋白酶。作用的最适温度为50°C,且在45⁵5°C间能保持较高酶活。纯化蛋白酶在30°C和40°C条件下能保持稳定状态,50°C时酶活开始有较大变化,在60°C和70°C条件下,酶活迅速下降。Mn²⁺对纯化蛋白酶有激活效果,K⁺、Mg²⁺、Fe³⁺对酶活有轻微抑制作用,Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺对酶活有明显抑制作用。纯化蛋白酶作用的最适条件与酱油发酵环境相一致,推测是发酵前期重要的蛋白酶。