84K杨再生和遗传转化体系的研究

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84K杨是韩国培育成功的银白杨和腺毛杨(Populus alba×Populus glandulosa)杂种无性系,因其生长快、繁殖迅速等特点逐渐成为杨树基因工程的重要受体树种。本文以84K杨为实验材料,研究并建立了两种不同的高效再生及遗传转化体系,结果如下:(1)在前人的研究基础上,选择6-BA、NA、TDZ三种激素对84K杨直接分化出芽再生体系进行实验优化,得到的高效再生培养基为:MS培养基+0.002mg·L-1TDZ+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA,分化率达到100%,平均每个叶片可分化出20-30个不定芽;(2)利用培养条件将脱分化与再分化过程分开,通过不同激素及培养基对84K杨进行再生实验,得到一个高效的经愈伤组织途径的再生体系。84K杨叶片在黑暗条件下诱导愈伤组织的高效培养基为MS+0.5mg·L-1KT+0.2mg·L-12,4-D;茎段为WPM+0.5mg·L-1KT+0.1mg·L-12,4-D;愈伤组织诱导出芽的高效培养基为WPM+0.05mg·L-1TDZ+0.5mg·L-16-BA。叶片或茎段愈伤组织诱导率可达到100%,愈伤组织分化出芽率最高达到98%,平均每个愈伤组织可出芽约30个;(3)84K杨外植体在Kan浓度为20mg·L-1的直接诱导出芽培养基和诱导愈伤培养基上时诱导出芽和诱导愈伤的能力被完全抑制:愈伤组织在Kan浓度为20mg·L-1的愈伤组织诱导出芽培养基上时分化出芽能力被抑制;浓度为250mg·L-1的Cef可有效抑制农杆菌生长,且对外植体诱导出芽和愈伤组织以及愈伤组织诱导出芽不产生影响;(4)利用L9(34)正交试验分析了84K杨外植体直接分化出芽遗传转化体系的预培养时间、菌液浓度、侵染时间和共培养时间4个因素的作用效果。结果表明,侵染前外植体不能进行预培养,经预培养的外植体与不经预培养的外植体的分化能力有很大差异。用于侵染的菌液浓度为OD6000.4~0.6,侵染时间10~15分钟,共培养时间2天为最佳转化方案。该遗传转化体系转化率可达到28%,但仍存在假阳性植株,假阳性植株所占比例达到35%;(5)建立了84K杨经愈伤途径的遗传转化体系。参考上一个方案的优化结果,对外植体进行侵染后,将外植体置于诱导愈伤组织培养基上进行选择培养,得到抗性愈伤后对愈伤组织进行出芽诱导。该转化体系的转化率可达到33%,未检测出假阳性植株。
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