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第一部分胰腺癌HH信号通路核转录因子Gli1的效应miRNAs的筛选目的:应用Affymetrix mi RNA3.0和Affymetrix HTA2.0芯片技术对胰腺癌细胞中提取的总RNA进行检测,差异筛选得到HH信号通路核转录因子Gli1的候选效应mi RNAs,在此基础上筛选获得候选效应mi RNA的靶基因集合。方法:参加检测的RNA分别来源于胰腺癌SW1990和Panc-1细胞,实验组为SW1990细胞转染Gil1基因和Panc-1细胞转染Gil1基因,对照组为SW1990细胞和Panc-1细胞,对两组实验共12个RNA样本进行检测,后续根据检测相关系数与P值进行差异筛选,获得候选效应mi RNAs和相应效应mi RNAs的靶基因集合。结果:1.RNA样品质检合格。2.Affymetrix mi RNA2.0芯片质量控制结果合格。3.Affymetrix HTA3.0芯片样品质控合格;芯片质量及杂交情况可靠。4.获得具有Gli1结合位点的效应mi RNAs3个即has-mir-301a-3p,has-mir-29b-1-5p,has-mir-1228-3p。5.获得效应mi RNAs的正负相关靶基因集合。结论:在Affymetrix mi RNA3.0和Affymetrix HTA2.0芯片技术的辅助下,准确、高效、完整地为我们提供了HH-Gil1的效应mi RNAs及其相应靶基因集合,为我们后续研究奠定了扎实的基础。第二部分胰腺癌HH信号通路核转录因子Gli1的效应mi RNAs的鉴定目的:应用染色体免疫共沉淀反应联合荧光定量聚合酶链式反应(Ch IP-QPCR)的实验方法验证候选效应mi RNAs能与HH-Gli1结合;并构建Gli1过表达载体,验证候选效应mi RNAs也能相应高表达,验证候选效应mi RNAs是Gli1的直接效应mi RNAs。方法:构建Gli1过表达载体,转染SW1990胰腺癌细胞,以此作为实验组,SW1990细胞为对照组,展开Ch IP-QPCR实验,其中实验组和对照组的实验又分为实验组(应用抗Gli1抗体)、阴参组(兔Ig G)、阳参组(应用抗RNA聚合酶Ⅱ抗体)和input组,经交联、超声破碎、抗体孵育、洗脱纯化后得到的DNA片段进行PCR检测,最终结果均以input的百分比表示,各自比较Gli1组与阴参组之间的差异,并将实验组与对照组的Gli1组进行比较,得到两组之间样品比值;构建Gli1过表达载体,转染SW1990胰腺癌细胞,以未转染组作为对照,检测相应效应mi RNAs表达情况。结果:1.构建Gli1过表达载体成功。2.转染Gli1基因成功的SW1990胰腺癌细胞(实验组)与SW1990细胞(对照组)分别进行Ch IP-QPCR,最终对照组的3个效应mi RNAs(即mi R-301a,mi R-29b-1,mi R-1228)的Gli1组与Ig G组相比,差异无统计学意义(P>0.05),而实验组的3个效应mi RNAs(即mi R-301a,mi R-29b-1,mi R-1228)的Gli1组与Ig G组相比,有差异且差异均有统计学意义(P<0.01)。3.三组效应mi RNAs(mi R-301a,mi R-29b-1,mi R-1228)的实验组与对照组的Gli1组比较,实验组均有不同水平的升高,分别是对照组的3倍,2.7倍和2倍。4.转染过表达Gli1载体的SW1990细胞中提取总RNA,检测mi R-301a,mi R-29b-1,mi R-1228的表达,三者均有高表达。结论:从上述实验结果中,我们可以初步得到mi R-301a,mi R-29b-1,mi R-1228是HH-Gli1的直接效应mi RNAs,这为我们今后寻找效应mi RNAs的靶基因奠定了基础。