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背景和目的:肝细胞性肝癌(Hepatocellular caricinoma,HCC)是世界上最常见的五大恶性肿瘤之一,每年约有500,000新发病例;尤其是在亚洲,因为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染率高,一些国家HCC发病率非常高,而西方一些国家由于丙型肝炎患者增多,HCC发病率也逐年升高。我国是HCC的高发国家,发病率居世界首位,死亡率位于恶性肿瘤死亡率的第二位。肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell,HSC)是肝癌微环境中的主要基质细胞,研究表明,它在促进肝癌的发生、发展方面发挥着重要作用。然而,现有的性状稳定的肝星状细胞系的种类仍然比较有限而且不易获得,而且临床手术标本来源有限,限制了研究的进一步开展。本实验的研究目是通过建立生物学性状稳定的人肝星状细胞系,以克服这一障碍,为后续实验研究提供可靠的细胞来源。
实验方法:我们首先运用胶原酶消化及percoll密度梯度离心的方法获得纯度高的人肝星状细胞,并对其进行初步鉴定,然后通过慢病毒感染的方法,将人端粒酶基因hTERT。导入原代肝星状细胞,用G418进行药物筛选,构建新的人肝星状细胞系(hTERT-hHSC)。我们通过Realtime PCR和免疫蛋白印迹等方法检测hTERT-hHSC的生物学特征。运用增殖实验、划痕实验及侵袭实验分别检测hTERT-hHSC是否能具有促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等肝星状细胞的特性。
结果:我们成功分离纯度高的人肝星状细胞。慢病毒感染将hTERT基因成功导入Primary-hHSC,并使hTERT-htiSC具有端粒酶活性。hTERT-hHSC基因表达情况基本与Primary-hHSC相同,除MMP-2、TIMP-2、MMP-14、PDGF-β表达量升高(P＜0.05)。转染后P10、P30、P50hTERT-hHSC相关基因表达稳定。免疫蛋白印迹显示hTERT-hHSC细胞α-SMA、PDL-1及PDFGR-β表达量同培养活化的肝星状细胞。hTERT-hHSC促进HepG2细胞增殖、迁移及侵袭。
结论:我们通过密度梯度离心的方法成功分离纯化人肝星状细胞,通过慢病毒感染的方法,成功建立生物学性状稳定的人肝星状细胞系hTERT-hHSC。