随着世界经济飞速发展，能源的供给与需求矛盾日益突出，特别是作为工业“命脉”的石油，因原油贮量的日益减少带来了严重的能源危机。目前我国以常规技术，原油采出率仅有30％左右，大量的石油尤其是高粘、高凝和高含腊油滞留在储油层。寻求高效和廉价的采油新技术一直是研究的热点。微生物提高原油采收率(MEOR)能大幅度提高石油采出率，被认为是当前开采枯竭油藏和油藏剩余油的最好技术，对于充分利用现有的油藏资源具有重大意义。另外，在石油的开采、运输与使用过程中，有时会发生石油外泄事故或不当排放，对环境造成严重污染。因具有应用范围广、操作简便、效果明显、成本低、不造成二次污染等优点，烃降解微生物是公认的最有效最彻底解决复杂烃类污染的手段。　　 从广义上讲，MEOR主要有三种不同方法策略:(1)生物表面活性剂在异地反应器生产，随后加入到贮油腔进行驱油;(2)直接向油藏中注入外来微生物，在油藏中生长繁殖，代谢产生促进原油流动的表面活性剂;(3)将营养物质注入油井中，刺激土著菌在油井内生产表面活性剂。生物表面活性剂广泛应用于微生物提高石油采收率和烃类污染物环境修复的领域中，其中效果最好、研究最多的就是鼠李糖脂。而阻碍鼠李糖脂成为MEOR主力军的原因主要有:成本高，产量过低;主要生产菌——铜绿假单胞菌是一种对人体有害的条件致病菌，不能应用于大规模的工业生产中。针对上述鼠李糖脂在实际应用中的一些问题，本论文从以下几个方面进行研究:　　 1.诱变筛选铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株　　 通过紫外诱变、硫酸二乙酯(DES)、等离子体和复合诱变等方法对铜绿假单胞菌SH6(1.2 g/L)进行了诱变育种，筛选高产菌株。经过多轮诱变后，筛选到一株高产突变株PZA(1)，最高鼠李糖脂产量4.0 g/L，再经过正交实验优化发酵培养基的配方，使PZA(1)的最高鼠李糖脂产量达到6.7 g/L且遗传稳定，比原始菌株提高了近5倍。　　 2.多拷贝复制启动子，构建铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂工程菌　　 据文献报道，真菌如瑞氏木霉和黑曲霉的多拷贝启动子能够提高目的基因的表达量。将鼠李糖脂合成的关键酶——鼠李糖基转移酶启动子序列中的功能区域，即318～479 bp，进行1、3、5拷贝的复制，并将之转化在铜绿假单胞菌中，分别构建了P.aeruginosa1P，P.aeruginosa3P，P.aeruginosa5P菌株。通过提高鼠李糖基转移酶的表达量，进而提高鼠李糖脂产量。实验结果显示，多拷贝启动子能够提高铜绿假单胞菌的鼠李糖脂产量，其中3拷贝启动子菌株的鼠李糖脂产量达到1.6 g/L，比野生株产量提高了30％;5拷贝启动子菌株的鼠李糖脂产量达到1.7 g/L，比野生株产量提高了40％，效果显著。　　 3.敲除PHA的合成基因，构建铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂工程菌　　 经检测，铜绿假单胞菌SH6既能产生鼠李糖脂，还能产生聚羟基烷酸酯(PHA)，而两者的代谢途径共用β-羟基脂肪酸为合成底物，所以通过敲除PHA的合成基因以阻断铜绿假单胞菌SH6中PHA的合成途径而使鼠李糖脂的合成获得更多的底物，继而提高其产量。用三亲杂交的方法分别敲除了PHA合成基因phaC和phaG，其中敲除株△phaG的PHA含量明显降低，其鼠李糖脂产量也比原始菌株提高了40％，产量达到1.7 g/L，但敲除phaC后效果甚微。　　 4.鼠李糖基转移酶在油井内嗜热菌中的异源表达　　 通过形态观察和分子生物学方法鉴定了两株筛选自油井内的嗜热菌株，鉴定结果为两株筛均属于Geobacillus属。根据Geobacillus属的研究报道，选择pNW33N质粒作为表达载体，将编码鼠李糖基转移酶的rhlABRI操纵子与之相连，构建成pNWAB重组质粒。在将pNWAB转化到嗜热菌的实验中，尝试了电转、感受态细胞化学转化和原生质体转化三种方法。将编码鼠李糖基转移酶的基因在油井中筛选到的嗜热菌中进行异源表达，既可以得到非致病性的宿主菌，还能构建出能够适应油井内特殊环境的原地生产生物表面活性剂的工程菌。