[目的]急性心肌梗死后缺血心肌发生不可逆的细胞损伤,而干细胞因为有极强的增殖和分化能力受到广泛关注和研究。骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMMSC)因其容易分离、培养,有较强的增殖和分化能力,以及较低的免疫原性成为研究的重点。已有研究表明BMMSC移植治疗心肌梗死能一定程度改善心功能,但其分化效率较低,不足以长期维持心功能。因此需要探索体外诱导BMMSC向心肌细胞分化的方法。诱导剂体外诱导BMMSC后移植到体内能明显提高其分化效率,5-氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-AZA)就是一种经典的体外诱导因子。但5-AZA有一定的细胞毒性,因此体外诱导细胞时多采用10 μmol/L的低浓度,诱导分化效率受到限制。整合素连接激酶(Intergrin-linked kinase,ILK)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,使用基因工程学方法使细胞ILK基因过表达能够促进细胞向心肌样细胞分化。因此本实验探索ILK过表达能否更好地促进5-AZA诱导的BMMSC向心肌细胞分化,并且探索ILK过表达是否能够减弱5-AZA的细胞毒性。[方法]从猪骨髓中分离培养贴壁细胞。细胞培养至第3代时,使用流式细胞仪进行BMMSC的表型鉴定。构建同时包含人野生型ILK cDNA和绿色荧光蛋白的重组腺病毒载体(Ad-GFP-ILK)及单独携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-GFP)。Ad-GFP-ILK在无血清培养基中转染细胞12小时后用流式细胞仪和荧光显微镜检测其转染率,最后确定最佳转染复数(Multiplicity of infection, MOI)为5：1。选取第三代生长良好的25 cm2的培养瓶的BMMSC,分为5组：空白对照组(N组),Ad-GFP转染组(Ad组),5-AZA诱导组(5-AZA组),Ad-GFP-ILK转染组(ILK组),Ad-GFP-ILK口5-AZA联合组(ILK+5-AZA组)。Ad-GFP和Ad-GFP-ILK转染细胞MOI均为5：1,而5-AZA体外诱导采用50μmol/L的较高刺激浓度。细胞分别在培养至2周和4周时行免疫细胞化学染色(Immunocytochemistry)检测肌钙蛋白I(cardiac Troponin I,cTnI)和alpha辅肌动蛋白(a-actinin)表达情况。第4周时提取蛋白行Werstern blotting明确cTnI、缝隙连接蛋白(Connexin-43,CX-43)、Caspase-3和ILK的表达。另外使用96孔板培养细胞,同样分成以上5组进行处理,然后用MTT法检测各组细胞活力。[结果]流式细胞仪检测BMMSC表型为CD45-CD34-CD90+CD44+CD29+,且ILK转染率达到90.3%。MTT法检测细胞活力,结果示Ad组、5-AZA组比N组、ILK组、ILK+5-AZA组细胞活力明显减弱,有统计学差异(P<0.05)；但Ad组和5-AZA组对比,N组、ILK组、ILK+5-AZA组每两组间对比均没有观察到统计学差异(P>0.05)。在细胞培养至2周时免疫细胞化学染色显示,5-AZA组、ILK组、ILK+5-AZ A组细胞开始表达心肌特异性标记物cTnI和a-actinin, N组和Ad组均没有明显阳性表达。Western blotting结果示ILK在ILK组和ILK+5-AZA组表达较其他组明显升高(P<0.05)。5-AZA组、ILK组、ILK+5-AZA组比N组、Ad组心肌特异性标记物cTnI表达明显升高,有统计学差异(P<0.05)；而5-AZA组、ILK组、ILK+5-AZA组每两组之间无明显差异,N组、Ad组之间也没有差异(P>0.05)。CX-43在5组间的表达趋势与cTnI相同。Caspase-3的表达在Ad组和5-AZA组较其他组明显升高,有统计学意义(P<0.05)；ILK+5-AZA组较5-AZA组表达明显降低,有明显差异(P<0.05)。[结论]ILK过表达能较快地促进BMMSC向心肌样细胞分化,其分化效率和较高浓度的5-AZA体外刺激无差异,且二者对心肌细胞分化无协同作用；ILK过表达对细胞增殖活力无影响,但能抵抗5-AZA的细胞毒性,有一定的抗凋亡作用。