论文部分内容阅读
肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是各种原因引起的慢性肝损害导致的病理过程,是发展为肝硬化甚至肝癌的必要阶段。肝纤维化作为一种可逆的瘢痕修复反应,在其形成过程中适当的干预可阻断甚至逆转肝纤维化。目前认为,肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化增殖在肝纤维化的形成中起关键作用。如何调控HSC的活化增殖是抗肝纤维化重点研究方向。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是一类由胞外酸化所激活的阳离子通道,属于ENa C/DEG家族,有四个编码基因编码的七种亚基蛋白:ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4。酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)作为ASICs家族的一员,活化时通道开放,介导Na+、Ca2+等离子的内流,进一步引起机体一系列病理和生理变化。微小RNA(micro RNA,mi RNA),是一类长约21～25个核苷酸的内源性单链非编码RNA,能通过降解靶基因的m RNA或与靶基因m RNA的3’-UTR碱基配对结合而干扰其转录过程,调控靶基因在蛋白水平的表达。mi RNA参与HSC活化、增殖和凋亡等生物学活性的调控,在肝纤维化的发生发展中扮演着重要的角色。通过高通量筛选体外活化的HSC中差异表达的mi RNAs,我们发现mi R-350在活化的HSC中表达上调;在狼蛛毒素(Pc Tx-1)特异性阻断ASIC1a后,mi R-350的表达也随之下调。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m~6A)是是最常见的一种转录后修饰,介导了超过80%的RNA甲基化,参与了mi RNA、m RNA等多种RNA的加工过程。文献报道,m~6A修饰可影响mi RNA的合成加工过程和多个水平的功能,使细胞mi RNA水平失衡。本课题从患者、动物和细胞水平上,研究ASIC1a在肝纤维化中的作用及其对m~6A甲基化修饰和mi RNA合成的调控机制,探讨ASIC1a/m~6A/mi RNA对HSC活化增殖的影响及其相关信号通路,为肝纤维化的发病机制研究提供依据,同时也为其防治提供新的靶点和思路。本课题首先采用Western blot,免疫组织化学和免疫荧光技术观察ASIC1a在体内外的表达。采用8型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated viral,r AAV)尾静脉注射小鼠体内沉默ASIC1a,在体外采用特异性抑制剂狼蛛毒素(Psalmotoxin-1,Pc Tx-1)和RNAi技术干扰ASIC1a的表达,检测m~6A和mi R-350的水平以及肝星状细胞(HSC)的活化和肝纤维化程度。体外RNAi技术用于进一步干扰mi R-350及其靶基因,以检测下游基因的变化。双重荧光素酶报告检测mi R-350与靶基因的结合位点。免疫共沉淀和RNA免疫沉淀观察m~6A相关酶调节mi R-350加工的机制。最后通过Western blot技术探究可能参与其中的信号通路。结果发现ASIC1a在肝纤维化患者肝组织和肝纤维化动物模型中的表达显着增加,与PDGF-BB诱导活化HSC中检测结果一致。下调ASIC1a的表达后,m~6A修饰的水平显著降低,mi R-350的表达也降低,并且HSC的活化受到抑制。免疫沉淀结果表明METTL3通过与DGCR8结合来调节pri-mi R-350的m~6A修饰水平。双荧光素酶报告实验结果表明mi R-350与靶基因SPRY2的3’UTR区域存在结合。mi R-350/SPRY2可以通过PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路参与HSC激活。以上结果表明,m~6A和mi R-350在ASIC1a促进HSC活化的过程中有重要作用。综上所述,ASIC1a通过依赖METTL3的m~6A修饰来调控mi R-350的加工,该修饰上调mi R-350的表达成熟并抑制其靶基因SPRY2的转录过程。抑制SPRY2可激活HSC中的PI3K/AKT和MAPK/ERK途径,并促进肝纤维化进展。