雨生红球藻的培养及其虾青素提取

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本文研究了雨生红球藻的培养和虾青素诱导累积的条件,并研究了从累积了虾青素的雨生红球藻中提取虾青素的工艺。该工艺包括雨生红球藻细胞破壁,虾青素的提取,虾青素酯的水解和游离虾青素的纯化分离。实验探讨了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)712株的适宜培养条件及藻体诱导累积虾青素的培养基条件。重点研究了温度、pH和光照条件对雨生红球藻营养生长的影响,以及NaNO3、Fe2+盐和乙酸钠浓度对雨生红球藻诱导累积虾青素含量的影响。结果表明,24℃、1000~1500LX连续光照,pH控制在8.0左右的生长条件适合雨生红球藻游动细胞增殖,生物量的增加。通过正交试验表明缺氮培养基对于雨生红球藻细胞累积虾青素最为有利,而高的FeSO4和乙酸钠浓度对虾青素的累积无显著性的影响。经过缺氮的BBM培养基,在24℃,24h连续光照,光照强度为5000LX的条件下进行验证实验,结果雨生红球藻细胞内累积的虾青素含量达到6.72μg/ml。 实验研究了直接用溶剂提取虾青素的工艺条件,结果表明,氯仿∶乙醇(1∶1,v/v)的混合溶剂最有利于从雨生红球藻孢子态细胞中提取出虾青素,较适的提取温度为40℃,较适的提取时间为45min。由于直接对雨生红球藻的细胞进行溶剂提取的提取率低,实验又研究了几种常用的机械破壁方法对雨生红球藻厚壁孢子细胞的破壁效果。结果表明, 高压均质法最适合于雨生红球藻厚壁孢子的破碎和虾青素的提取。高压均质的优化条件为:40MPa, 循环3次, 室温, 破壁率达到91.4%, 虾青素提取率为28.0μg/mg(细胞干重), 比未经破壁处理的提取率提高了10.1μg/mg(细胞干重),提高了56.3%。由于雨生红球藻中虾青素95%以上都是以虾青素酯的形式存在,虽然虾青素酯比游离虾青素更为稳定,且部分报道认为虾青素酯生理活性与游离虾青素相当,但是由于虾青素酯的脂肪酸构成复杂,缺少标准样品对照,较难定性进行研究。因此,我们利用酯类的皂化反应将虾青素酯水解成游离虾青素,实验研究了碱浓度、皂化温度和时间对游离虾青素得率的影响。结果表明:4%KOH-甲醇皂化液<WP=6>在15℃下皂化10min的工艺,得到的游离虾青素占总类胡萝卜素的含量从未皂化前的4.1%提高到81.9%。为了得到更纯的游离虾青素,实验通过硅胶柱层析进一步纯化了游离虾青素。最终得到的游离虾青素样品经过红外光谱检测,结果表明其分子结构与标准样品完全相同。未经柱层析时游离虾青素得率为21.7μg/mg(细胞干重),经200目硅胶G柱层析后,经TLC分析只有游离虾青素一个色素斑点,经HPLC结合折光指数检测器分析,游离虾青素的纯度达到98%以上,但经柱层析后的游离虾青素得率下降至16.5μg/mg(细胞干重)。
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