烟草曲茎病毒（tobacco curly shoot virus,TbCSV）属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（begomovirus）的单组份双生病毒。该病毒DNA-A组分可独立侵染,也可以伴随β卫星（tobacco curly shoot betasatellite,TbCSB）复合侵染寄主,被认为是介于不需伴随卫星和必须伴随卫星致病的单组分双生病毒之间的进化中间型。TbCSV可通过烟粉虱（Bemisita tabaci）传播,长期在我国西南地区上广泛发生,是番茄、辣椒和烟草发病的重要病原,给多种农作物和经济作物的生产造成了巨大的经济损失。有研究表明,菜豆金色花叶病毒属的V2蛋白是一个多功能蛋白,可参与病毒的致病,移动和抑制寄主的基因沉默等一系列过程,在病毒与寄主的相互作用中起着重要作用。目前对TbCSV V2蛋白在病毒侵染过程中的功能还未见报道。本研究克隆TbCSV V2编码基因序列,通过过表达及病毒基因缺失突变分析其对病毒侵染及寄主生长发育的影响,并分析了V2的亚细胞定位、细胞坏死诱导及基因沉默抑制活性等基本生物学特性,进一步通过氨基酸点突变研究了V2几种生物学特性之间的相关性。以期了解TbCSV中的V2是否参与病毒致病过程及其调控致病性的分子机制,为研究病毒的侵染致病机制及病害的有效防控提供依据。为了明确TbCSV V2的致病性,构建了V2的PVX过表达载体和缺失突变体侵染本氏烟,结果发现PVX介导V2过表达可导致植株叶片的系统性坏死,并且通过RT-q PCR检测,发现PVX-V2处理中PVX的积累量与对照组PVX-GUS相比显著升高。TbCSV V2突变的侵染性克隆侵染本氏烟后无明显症状,与病毒卫星TbCSVB共侵染可导致明显减弱的叶片卷曲和皱缩,发病率明显降低且病毒积累量减少,这说明了TbCSV V2是病毒致病所需要的重要蛋白。本研究进一步探究TbCSV V2是否具有沉默抑制子活性。结果发现,接种p GD-GFP+p GD-V2的植株叶片有明显的绿色荧光,与接种p GD-GFP+p GD-P19植株叶片的绿色荧光强度相比稍弱,阴性对照p GD-GFP+p GD无绿色荧光。Western blot实验证实p GD-GFP与p GD-V2共浸润叶片中GFP蛋白积累与阳性对照相似,这些实验结果说明了TbCSV V2同P19一样是一个RNA沉默抑制子,抑制转录后基因沉默（PTGS）。为了进一步探究V2的生物学功能,分析V2在TbCSV侵染过程中的表达模式,本研究构建了Y35-FLAG的侵染性克隆。结果发现,TbCSV V2蛋白的在接种本氏烟后10dpi左右表达量最高,15dpi次之,5dpi时最低,TbCSV病毒积累量从5dpi开始升高,在15dpi左右时达到最高,15dpi后病毒积累量开始下降。V2蛋白由115个氨基酸构成,为明确V2抑制RNA沉默的关键区域和氨基酸位点,本研究通过对V2功能域的生物信息学分析,构建了一系列截短突变体并鉴定其沉默抑制活性。结果发现,V2蛋白的第6到110位氨基酸具有基因沉默抑制活性。为了筛选V2抑制RNA沉默的关键位点,通过氨基酸序列多重比对并结合关键氨基酸区域筛选结果,将V2序列中可能参与RNA结合的10个碱性氨基酸和5个环状侧链氨基酸进行丙氨酸扫描突变。结果发现,突变位点中进化保守的碱性氨基酸如组氨酸、精氨酸和赖氨酸或环状侧链氨基酸中的苯丙氨酸和酪氨酸突变后V2失去沉默抑制活性。而不保守的第95位赖氨酸突变为丙氨酸后不影响V2的沉默抑制活性。前期有报道显示PVX与某些异源病毒沉默抑制子共表达时会诱导HR反应,根据以上结果,将影响V2基因沉默抑制活性的第9位苯丙氨酸和第105位赖氨酸及不影响其沉默抑制活性的第105位赖氨酸氨酸分别插入PVX载体进行系统过表达,以明确V2沉默抑制活性与诱导细胞坏死的相关性。结果显示,V2第9位苯丙氨酸突变后对其诱导细胞坏死无显著影响,而第105位赖氨酸突变后其所诱导的细胞坏死有明显减弱,并且V2第9位和第105位氨基酸的突变可导致细胞质中大聚集体明显减少。