光呼吸是C3植物一个重要的生理过程，羟基丙酮酸还原酶(HPR)是光呼吸代谢途径中催化羟基丙酮酸还原成甘油酸的一个关键酶，其活性远高于该途径中的其他酶的活性。光呼吸途径中所有酶的缺失突变体中，唯独HPR的缺失突变体不具有光呼吸突变体表型。本文以转基因Hpr—1纯合子水稻为材料探讨其生理功能，旨在进一步阐明光呼吸的生物学意义。本论文同时研究异柠檬酸裂解酶(ICL)与水稻草酸积累的关系，对了解植物草酸积累机理和进一步阐明植物草酸的生理功能均具有重要意义。本论文获得的主要研究结果如下： 1. ICL过量表达转基因水稻植株的构建 通过特异引物从水稻中克隆出Ic1的cDNA，选取适合片段分别构建了超表达载体用于转化水稻愈伤，经筛选、分化后获得转基因植株。并用测定酶活的方法对所获得的转基因植株进行了鉴定。酶活测定的结果显示，T1代大部分株系酶活均有提高，其中酶活最高的株系，酶活提高了150倍左右。 2. ICL活性与水稻草酸积累的关系 草酸可以在某些植物体内大量积累，一般认为叶片是草酸合成的主要场所，但是其合成途径尚未有定论，光呼吸乙醇酸/乙醛酸氧化途径一般被认为是草酸可能合成途径之一，异柠檬酸裂解酶可以催化异柠檬酸裂解为琥珀酸和乙醛酸。在转基因植株中，随着ICL酶活提高，草酸含量同步上升。 3.Hpr基因mRNA及蛋白水平的分析 植物中除了依赖于NADH的Hpr—1之外，还存在着依赖于NADPH的Hpr—2。根据拟南芥Hpr—2基因序列比对得到两条水稻中Hpr—2，即Hpr2—1，Hpr2—2。这两条序列核苷酸相似性达95％，蛋白同源性达83％，此外Hpr—1基因与Hpr—2基因序列核苷酸酸无相似性，但蛋白同源性达32％—35％。 原初RNAi和超表达Hpr—1的转基因水稻由叶能辉师兄构建，本研究作了进一步筛选，获得了纯合子后代。以野生型、过量表达、RNA干涉Hpr—1水稻为材料，半定量RT-PCR分析了基因表达情况，结果显示：过量表达水稻叶片中的Hpr—1的表达量大大提高；而干涉叶片中的Hpr—1几乎没有表达。水稻根中的Hpr—1很难检测到，但是在过量表达水稻的根中Hpr—1表达量大大提高。Hpr—2基因表达水平却没有发生改变。说明Hpr—1表达与否和表达高低不影响Hpr—2基因表达，二者之间不存在相互调控的关系。进一步的Western杂交结果显示，在超表达水稻叶中HPR蛋白表达大大提高，分子量为41KD，与理论推算相符；但是根中检测到的HPR蛋白分子量为33KD，比叶片的小了8kD左右。 4.Hpr—1基因功能的初步分析 (1)二种转基因水稻的生长表型：干涉转基因植物光呼吸受阻，生长受到抑制，特别是在高光强的自然天气下，干涉植株叶片较薄，叶片颜色呈黄绿色，根系生长缓慢，整体植株明显比野生型矮小。超表达植株生长状态稍微优于野生型。 (2)其它光呼吸酶的活性变化：在NADH—HPR活性几乎为零的干涉植株中，其GLO活性还有提高趋势，SGAT活性无变化。在NADH—HPR活性增加了一倍的超表达植株中，GLO活性下调，SGAT则呈上升的趋势，但上升趋势不显著。 (3)有机酸含量的变化：在NADH—HPR活性几乎为零的干涉植株中，其底物羟基丙酮酸大量积累(野生型几乎检测不到)，乙醛酸、草酸和α—酮戊二酸也呈提高趋势，而丙酮酸含量降低；在NADH—HPR活性增加了一倍的超表达植株中，其底物羟基丙酮酸同野生型中一样几乎观测不到，乙醛酸和草酸均有提高，α—酮戊二酸则下降。 (4)氨基酸含量变化：在上述干涉植株中，丝氨酸、谷氨酰铵含量大幅度提高；天冬酰氨含量也有提高，而天冬氨酸含量降低；在上述超表达植株中，谷氨酰铵含量呈下降趋势；天冬酰氨含量也有提高，而天冬氨酸含量几乎没有变化。