双抗体夹心法检测肺炎衣原体循环免疫复合物的方法学建立

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目的:建立一种敏感而且特异的双抗体夹心法检测血液中的循环免疫复合物(CIC),并讨论血液中肺炎衣原体(Cpn)CIC与冠心病的关系。方法:本实验分为三个阶段。1.第一阶段为根据传统双抗体夹心间接法检测血清中的CpnCIC。在PVD酶标板上包被已知特异性羊抗人IgG单克隆抗体(CpnTW183IgG),4℃过夜。接着加入经过7%聚乙烯乙二醇6000(PEG6000)沉淀处理的,从冠心病患者血清中提取的大分子蛋白质,与固相抗体反应。再加入特异性鼠抗人CpnTW183IgG,与大分子蛋白质中可能存在的CpnCIC中的CpnAg结合。然后加入辣根过氧化物酶(HRP-)标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体。最后,通过底物显色反应检测患者CpnCIC阳性率。2.第二阶段根据第一阶段实验结果,建立新的简便敏感的双抗体夹心法。包被鼠抗人CpnTW183IgG,4℃,过夜。再加入经过7%聚乙烯乙二醇6000(PEG6000)沉淀处理的,从冠心病患者血清中提取的大分子蛋白质,与固相抗体反应。然后加入HRP-羊抗人IgG单克隆抗体孵育。最后,通过底物显色反应检测患者CpnCIC阳性率。3.第三阶段为补充实验。根据分子生物学检测细胞核粗提物中检测到极微量的DNA序列特异性结合蛋白的凝胶滞后实验而推导衍生出来的已知特异性抗体与待测抗原抗体复合物结合的凝胶滞后实验。本法采用非变性,非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。选取第二阶段实验确证为阳性的血清标本如上述方法处理,样品分为两份。一份与鼠抗人CpnTW183IgG于37℃孵育2小时,反应后的混合液与另一份样品加入8%的聚丙烯酰胺凝胶板中,40mA约4小时。胶板经过考马斯亮兰染色4小时,最后脱色4—5次。结果:1.传统间接双抗体夹心法检测待检标本,阴性对照,空白对照,均出现强阳性或假阳性。2.改进后的方法检测冠心病组CpnCIC的阳性率(63.8%)高于对照组CpnCIC的阳性率(40.0%),经过统计学检验,差异具有显著性意义(x~2=7.78,P<0.05)。3.凝胶滞后实验检测已知CpnCIC阳性标本出现滞后条带。结论:1.传统的双抗体夹心间接法在此不能特异地检测出血清中的CpnCIC。2.本实验建立的双抗体夹心法检测CpnCIC有较高的敏感性和特异性,可用于批量临床标本的检测;血清中中分子量CpnCIC的存在与冠心病之间有密切关系。3.本实验建立的新的滞后实验能够有效的检测出血清中的CpnCIC。
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