研究背景Cav1.2钙离子通道是心脏兴奋-收缩偶联过程中重要的的Ca2+操纵蛋白之一,激酶和磷酸酶控制的Cav1.2磷酸化水平平衡是维持其正常功能的关键。已知PP2A是参与调节Cav1.2去磷酸化的一种磷酸酶,但是其具体的调节机制还不是十分清楚。由于PP2A全酶的结构非常复杂,虽然PP2A的催化亚基只有两种亚型,但决定全酶作用底物特异性的调节亚基之种类却很庞大,这就使得细胞中PP2A的种类有几十种之多,具体是哪一种或几种调节亚基决定了 PP2A全酶对Cav1.2靶向性以及调控机制目前仍不清楚。研究目的1.生理条件下,心肌Cav1.2钙离子通道的磷酸化水平更多是由磷酸酶的活性来决定,虽然已有文献报道磷酸酶PP2A参与调控了 Cav1.2的磷酸化水平,但参与调控Cav1.2-Ser1928位点磷酸化水平的PP2A调节亚基种类以及作用机制仍不清楚。因此,我们关注的第一个问题是生理条件下,究竟是某一种还是多种B亚基呈递PP2A全酶到Cav1.2信号复合物中,发挥调节作用?其机制是何?2.在心脏病理条件下,由于Cav1.2钙离子通道磷酸化水平的改变导致其活性受影响,从而使得心肌细胞兴奋-收缩偶联改变而收缩力受损。同时在缺血性或非缺血性心衰条件下,PP2A调节亚基表达也会发生不同程度的改变。然而,这种改变与Cav1.2钙离子通道磷酸化水平之间的联系是何,目前也不清楚。因此我们关注的第二个问题是心脏病理条件下,Cav1.2磷酸化水平的变化是否与PP2A调节亚基的表达改变有关,以及PP2A调节亚基调控PP2A靶向去磷酸化Cav1.2 Ser1928位点的机制。本课题将通过以下两部分研究回答上述问题。第一部分生理条件下参与Ser1928-Cav1.2去磷酸化调控的PP2A调节亚基种类的鉴定及作用机制材料与方法1.利用免疫共沉淀（IP）的方法,检测小鼠心室肌细胞中与Ser1928-Cav1.2结合的PP2A调节亚基种类。2.在体外培养的H9c2细胞过表达PP2A调节亚基,检测其对Ser1928-Cav1.2磷酸化水平的作用。3.利用体外磷酸酶实验,分别检测PP2A调节亚基对Cav1.2的去磷酸化作用。实验结果1.在小鼠心室肌细胞中,Cav1.2仅与PP2A调节亚基的B’家族结合,而与B/B"B’"家族都不结合,而磷酸化的Ser1928-Cav1.2仅与B’家族中PPP2R5A、PPP2R5D和PPP2R5E结合,提示PPP2R5B和PPP2R5C可能参与Cav1.2其他位点的去磷酸化调控。2.在H9c2细胞分别过表达PP2A调节亚基B’家族各亚型,结果显示,B’家族所有成员不仅可显著降低Cav1.2的磷酸化水平,而且促进Cav1.2总蛋白和p-Ser1928-Cav1.2 的蛋白表达,其中 PPP2R5C 和 PPP2R5D 对 Cav1.2 mRNA 水平的表达也有促进作用。3.PP2A抑制剂冈田酸（OA）处理H9c2细胞,B’家族过表达所致的Cav1.2总蛋白和p-Ser1928-Cav1.2蛋白表达增加、以及Cav1.2 mRNA表达的增加均被抑制,但Cav1.2磷酸化水平的下调并未被逆转。4.用放线菌酮（CHX）和自噬溶酶体抑制剂（Lis）分别抑制蛋白合成与降解途径,结果显示,PP2A调节亚基B’家族过表达所致的Cav1.2和p-Ser1928-Cav1.2表达增加回复到对照水平,提示B’亚基既可能通过Cav1.2蛋白合成也可能通过降解途径影响Cav1.2或p-Ser1928-Cav1.2的表达,但B’家族对Cav1.2的磷酸化水平的调控却不依赖于Cav1.2的蛋白合成和降解。5.利用体外磷酸酶实验,分别将纯化的B’亚基与纯化的p-Ser1928-Cav1.2孵育,结果显示仅PPP2R5A、PPP2R5D、PPP2R5E能够在体外去磷酸化Cav1.2,提示这三者是介导PP2A全酶到Cav1.2信号复合物中的主要B亚基,而PPP2R5B和PPP2R5C可能是通过影响Cav1.2的蛋白表达来影响Cav1.2的去磷酸化水平。结论在生理条件下,心肌Cav1.2钙离子通道Ser1928位点的去磷酸化调控主要由PP2A调节亚基B’家族PPP2R5A、PPP2R5D和PPP2R5E介导,且这种调控主要通过两种方式:1,调节Cav1.2的蛋白合成或蛋白稳定性;2,与Ser1928-Cav1.2直接结合介导PP2A的去磷酸化。第二部分心脏病理条件下PP2A调节亚基B’家族对Ser1928-Cav1.2磷酸水平的调控机制材料与方法1.分离大鼠原代心肌细胞,加入1μM异丙肾上腺素（ISO）分别处理不同时间,模拟体外心肌肥大模型,检测Ser1928-Cav1.2的磷酸化水平与PP2A调节亚基表达水平之间的联系。2.选用8周龄雄性C57BL/6小鼠皮下注射ISO构建心衰模型（5 mg/kg/day,连续注射7天）,检测心脏病理条件下,Ser1928-Cav1.2的磷酸化水平与PP2A调节亚基表达水平之间的联系。3.通过构建B’亚基PKA磷酸化不同作用位点突变体及siRNA等方法探究PP2A调节亚基介导PP2A调控Ser1928-Cav1.2磷酸化水平的机制。实验结果1.在体外培养的原代大鼠心肌细胞中,加入ISO处理,Ser1928-Cav1.2的磷酸化水平和PP2A调节亚基B’家族的蛋白表达均4 h时达到最高,随着ISO处理时间的延长而降低。在此过程中,PP2A调节亚基PPP2R5A、PPP2R5D和PPP2R5E的与p-Ser1928-Cav1.2的结合量在4 h达高峰,随后下降。2.在ISO诱导的小鼠心衰模型中,Cav1.2以及p-Ser1928-Cav1.2的蛋白表达同时上调,但Cav1.2的磷酸化水平下降;另外PP2A的催化亚基、支架亚基以及调节亚基B’家族的表达显著增加,而调节亚基B/B”家族没有明显改变,PP2A酶活性降低。3.用抗p-Ser1928-Cav1.2抗体进行IP实验,检测到心衰小鼠心室肌细胞中与Ser1928-Cav1.2结合的调节亚基中PPP2R5A、PPP2R5D和PPP2R5E含量均显著增加,而一步用抗PP2A催化亚基抗体进行IP实验,结果显示PP2A全酶复合物中仅能检测到PPP2R5D的含量显著增加,其他B’调节亚基的含量却减少,暗示了 Cav1.2磷酸化水平降低与PPP2R5D介导的PP2A酶活之间存在某种联系。4.在体外过表达PP2A调节亚基B’家族,加入ISO激活PKA,与仅转染空载的对照相比,PPP2R5A、PPP2R5B、PPP2R5C 提高了 Cav1.2 磷酸化水平,而 PPP2R5D和PPP2R5E则降低了 Cav1.2的磷酸化水平,提示PP2A调节亚基B’家族自身的磷酸化水平对PP2A全酶活性有显著影响,从而影响Ser1928-Cav1.2的磷酸化状态。5.通过构建一系列PPP2R5D中不同的PKA磷酸化位点突变体,转入H9c2细胞,加入ISO激活PKA后检测其变化,结果显示,Ser566位的突变体失去了 Cav1.2的去磷酸化作用。6.通过siRNA方法干扰原代大鼠心肌细胞中PPP2R5D的表达之后,Cav1.2的蛋白表达下调,磷酸化水平提高,这一过程中并没有观察到其他调节亚基的代偿性表达增加,这些结果说明PPP2R5D对Cav1.2的去磷酸化作用是特异性的。结论在ISO诱导的心衰病理条件下,Cav1.2钙离子通道的磷酸化水平下调,而这与PPP2R5D靶向呈递PP2A全酶到Cav1.2信号复合物中有关。